Что означает иммобилизация ферментов

Иммобилизованные ферменты. Носители, промышленные процессы

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ

Иммобилизованными ферментами называются ферменты, ис­кусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраня­ющие свои каталитические свойства.

Еще в 1916 г. Дж. Нельсон и Е.Гриффин показали, что сахаро­за, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую ак­тивность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осу­ществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем.

В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно — полное или частичное ограничение свободы движения белковых молекул.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего такие фер­менты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко от­деляются от реакционной среды, могут использоваться многократ­но и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активнос­ти от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговеч­ны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65 °С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60%-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным фер­ментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использу­ющих иммобилизованные ферменты.

4.1. Носители для иммобилизации ферментов

По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основ­ными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и био­логической стойкостью; значительной гидрофильностью; доста­точной проницаемостью как для ферментов, так и для кофермен- тов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

Естественно, ни один из используемых в настоящее время в качестве носителя материал не отвечает полностью перечислен­ным требованиям. Тем не менее существует широкий набор носи­телей, пригодных для иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.

Органические полимерные носители. Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органичес­кой природы. Существующие органические полимерные носите­ли можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов орга­нических полимерных носителей подразделяется на группы в за­висимости от их строения. Среди природных полимеров выделя­ют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических — полиметиленовые, полиамидные и полиэфир­ные.

К преимуществам природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недо­статкам — биодеградируемость и достаточно высокую стоимость.

Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто исполь­зуют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для прида­ния химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и дек- страна поперечно сшивают эпихлоргидрином. В полученные сет­чатые структуры довольно легко вводят различные ионогенные группировки. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) син­тезирован новый носитель — губчатый крахмал, обладающий по­вышенной устойчивостью к гликозидазам.

Из природных аминосахаридов в качестве носителей для им­мобилизации применяют хитин, который в значительных коли­чествах накапливается в виде отходов в процессе промышленной переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет хорошо выраженную пористую структуру.

Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена — желатина. Эти белки широко распространены в природе, поэтому доступны в значи­тельных количествах, дешевы и имеют большое число функцио­нальных групп для связывания фермента. Белки способны к био­деградации, что очень важно при конструировании иммобилизо­ванных ферментов для медицинских целей. К недостаткам белков как носителей в этом случае следует отнести их высокую иммуно- генность.

Синтетические полимерные носители. Благодаря разнообразию и доступности материалы этой группы широко используются как носители для иммобилизации. К ним относятся полимеры на ос­нове стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; по­лиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтети­ческих полимерных носителей обладают механической прочнос­тью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функци­ональных групп. Некоторые синтетические полимеры могут быть произведены в различных физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны для разных способов иммоби­лизации ферментов.

Носители неорганической природы. В качестве носителей наи­более часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды ме­таллов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гаф­ния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей — легкость регенерации. Подобно синтетическим полимерам неорганическим носителям можно придать любую форму и получать их с любой степенью пористости.

Итак, к настоящему времени создано огромное число разнооб­разных носителей для иммобилизации ферментов. Однако для каж­дого индивидуального фермента, используемого в конкретном тех­нологическом процессе, необходимо подбирать оптимальные ва­рианты как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

4.2. Методы иммобилизации ферментов

Существуют два принципиально различных метода иммобили­зации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические ме­тоды иммобилизации). Каждый из этих методов осуществляется разными способами (рис. 4.4).

К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невы­сокую прочность связывания фермента с носителем. При измене­нии условий иммобилизации могут происходить десорбция фер­мента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами — полимерами, белками, гид­рофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фер­мента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную струк­туру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных ком­плексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вво­дят в водный раствор мономера, а затем проводят полимериза­цию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фер­мента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное со­стояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго — гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фос­фата кальция.

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность много­кратного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, дей­ствующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущ­ность этого способа иммобилизации заключается в отделении вод­ного раствора фермента от водного раствора субстрата с помо­щью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолеку­лярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модифика­ций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

Первый способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой мик­рокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверх­ности водных микрокапсул фермента заключается в реакции меж­фазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое — в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микро­капсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиа- мина-1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кисло­ты (органическая фаза):

Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни мик­рометров, а толщина мембраны — сотые доли микрометра.

Достоинства метода микрокапсулирования — простота, уни­версальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулиро­вания могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток. К недостаткам метода следует отне­сти невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

Близким к инкапсулированию методом иммобилизации мож­но считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был приме­нен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит само­сборка бислойных липидных структур липосомы, содержащий включенный раствор фермента.

Ферменты, иммобилизованные путем включения в структур липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализо­вана в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для пониманий закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

Другие приемы иммобилизации ферментов, основанные физических методах, менее распространены по сравнению с рассмотренными выше.

Химические методы иммобилизации ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем — наиболее массовый способ получений промышленных биокатализаторов.

В отличие от физических методов этот способ иммобилизации обеспечивает прочную и необратимую связь фермента с носите­лем и часто сопровождается стабилизацией молекулы энзима. Од­нако расположение фермента относительно носителя на расстоя­нии одной ковалентной связи создает стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональ­ные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом встав­ляют последовательность —СН2—NH—(СН2)5—СО—. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, встав­ку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями (рис. 4.5).

Принципиально важно, чтобы в иммобилизации фермента уча­ствовали функциональные группы, не существенные для его ка­талитической функции. Так, гликопротеины обычно присоединя­ют к носителю через углеводную, а не через белковую часть моле­кулы фермента.

Число методических приемов, разработанных для осуществле­ния ковалентной иммобилизации ферментов, исключительно ве­лико. Все методы химической иммобилизации классифицируют в зависимости от природы реакционной группы носителя, вступа­ющей во взаимодействие с молекулой фермента. Ниже представ­лен ряд примеров, иллюстрирующих некоторые способы хими­ческой иммобилизации ферментов.

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих гидроксогруппами. Наиболее распространенным методом образования ко­валентной связи между ферментом и полисахаридным носителем или синтетическим диольным соединением является бромциано- вый метод, который был предложен Р.Аксеном, Дж.Поратом и С. Эрнбаком в 1967 г. При обработке носителя бромцианом возни­кают реакционноспособные цианаты и имидокарбонаты, кото­рые при взаимодействии с нуклеофильными аминогруппами фер­мента образуют производные изомочевины и уретанов:

Иммобилизация ферментов на носителях, обладающих амино­группами. Первичные аминогруппы носителя, связанные с аро­матическим кольцом, предварительно превращают в соли диазония, которые затем подвергают разнообразным реакциям сочета­ния. В реакции сочетания вступают фенольные, имидазольные, аминные, гуанидиновые, тиольные группы белков. Так, в щелоч­ной среде фенольные радикалы тирозина образуют прочные азо­соединения, в составе которых белок связан с носителями:

Существенно, что n-аминофенильные функции могут быть легко введены в разнообразные носители.

Иммобилизация на носителях, обладающих активированными производными карбоксильной группы. Наиболее часто для соедине­ния аминогрупп белка с ацильными группировками носителя ис­пользуют ангидриды, галогенангидриды, активированные эфиры и другие производные карбоновых кислот. Например,

Реакционная способность производных карбоновых кислот в реакциях ацилирования аминогрупп фермента уменьшается от галогенангидридов до эфиров.

Иммобилизация на носителях, обладающих сульфгидрильными группами. Сульфгидрильные группы носителя и фермента легко окисляются с образованием дисульфидных связей под действием кислорода воздуха:

Иммобилизация путем химического присоединения биоката­лизатора к носителю отличается высокой эффективностью и проч­ностью связи. Несмотря на это, методы ковалентной иммобили­зации ферментов все еще малодоступны для промышленного ис­пользования в связи со сложностью и дороговизной их примене­ния. Однако они остаются незаменимыми инструментами в прак­тике проведения научных и лабораторных исследований по созда­нию энзимов с контролируемыми свойствами.

4.3. Иммобилизация клеток

Методы иммобилизации универсальны для всех видов иммо­билизованных биокатализаторов — индивидуальных ферментов, клеток, субклеточных структур, комбинированных препаратов.

Наряду с иммобилизацией ферментов в последнее время все большее внимание уделяется иммобилизации клеток и субклеточ­ных структур. Это объясняется тем, что при использовании иммо­билизованных клеток отпадает необходимость выделения и очис­тки ферментных препаратов, применение кофакторов; создается возможность получения полиферментных систем, осуществляю­щих многостадийные непрерывно действующие процессы.

В промышленных процессах чаще используют покоящиеся клетки. Действительно, многие хозяйственно-ценные продукты синтезируются главным образом в стационарной фазе развития клеточных культур. Растущие клетки нарушают структуру носи­теля. Образующиеся при делении дочерние клетки, покидая носитель, загрязняют целевой продукт. Для подавления роста им­мобилизованных клеток растений используют дефицит фитогормонов, а рост клетки бактерий тормозят добавлением антибио­тиков.

Иммобилизованные клетки микроорганизмов применяют для биотрансформации органических соединений, разделения раце­мических смесей, гидролиза ряда сложных эфиров, инверсии са­харозы, восстановления и гидроксилирования стероидов. Иммо­билизованные хроматофоры используют в лабораторных установ­ках для синтеза АТФ, а пурпурные мембраны — для создания искусственных фотоэлектрических преобразователей — аналогов солнечных батарей. Разрабатывается реактор на основе иммоби­лизованных клеток дрожжей для получения этанола из мелассы, в котором дрожжи сохраняли бы способность к спиртовому броже­нию в течение 1800 ч. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов иммобилизована и используется для целей ин­женерной энзимологии примерно десятая часть (преимуществен­но оксидоредуктазы, гидролазы и трансферазы).

Для осуществления химических процессов с помощью иммо­билизованных ферментов применяют колоночные, трубчатые, пла­стинчатые и танкерные реакторы разного объема и производи­тельности. Иммобилизованные ферментные системы функциони­руют в биореакторе в виде неподвижной фазы, через которую про­текает среда с субстратом, подлежащим химическому превраще­нию (гетерогенный катализ). В таких реакторах наряду с непрерыв­ным режимом используется и периодический. Для эффективного перемешивания и газообмена биореактор снабжают мешалкой. По­вреждающее действие мешалки на биокатализатор устраняют, зак­репляя определенным образом его гранулы. Например, в биореак­торе «корзиночного» типа мешалка вращается в полом цилиндре из сетчатой структуры (корзина), в ячейках которой закреплен им­мобилизованный фермент. Во внутреннем объеме трубчатых реак­торов рыхло расположены полые волокна, заполненные биоката­лизатором. Степень превращения субстрата в продукт (например, фумарата аммония в аспартат) в таких реакторах достигает 90 %.

4.4. Промышленные процессы с использованием иммобилизованных ферментов и клеток

Сочетание уникальных каталитических свойств энзимов с пре­имуществами иммобилизованных ферментов как гетерогенных катализаторов позволило создать новые промышленные техноло­гические процессы. Следует отметить, что все они относятся к производству пищевых продуктов и лекарственных препаратов.

В настоящее время в мире разработаны следующие крупномас­штабные производства с использованием иммобилизованных фер­ментов и клеток:

В качестве примера рассмотрим некоторые из них.

Получение глюкозофруктозных сиропов. Фруктоза (фруктовый, плодовый или медовый сахар) — важнейший в физиологическом и технологическом отношении природный моносахарид. Превращаясь в печени и кишечнике млекопитающих в глюкозу, фруктоза включается в пластический и энергетический обмен клетки. Она в 2,5 раза слаще глюкозы и в 1,7 раза слаще тростникового сахара (сахароза), благодаря чему фруктоза — менее калорийный пище­вой продукт по сравнению с последними. В отличие от глюкозы обмен фруктозы не контролируется инсулином, поэтому фрукто­вый сахар может потребляться больными диабетом. Фруктоза прак­тически не вызывает кариеса зубов. В смеси с глюкозой фруктоза не кристаллизуется, поэтому широко используется для производ­ства кондитерских изделий.

Получение L-аминокислот из их рацемических смесей. Наряду с микробиологическими способами важное значение имеют химические методы промышленного получения природных амино­кислот, в том числе незаменимых. Однако в результате химических реакций, используемых для синтеза аминокислот, содержащих асим­метрические атомы углерода, с одинаковой скоростью образуются как D-, так и L-стереоизомеры, т.е. всегда возникает рацемическая смесь. Между тем в живых клетках обмену подвергаются лишь L-аминокислоты. Разделение рацемических смесей на составляющие их оптические изомеры (представляющее труднейшую задачу) яви­лось первым промышленным процессом с использованием иммобилизованных ферментов. Этот процесс был осуществлен в Японии в 1969 г. (компания «Танабе Сейяку») с помощью аминоацилазы, иммобилизованной на ДЕАЕ-целлюлозе. В качестве исходных соединений в данном превращении используют N-ацилированные произ­водные D-,L-аминокислот, получаемые с помощью химического синтеза. Вследствие своей стереоспецифичности аминоацилаза гидролизует лишь N-ацил-L-стереоизомер, отщепляя от него ацильныйрадикал, в результате чего растворимость образующейся L-аминокислоты резко возрастает и ее легко можно отделить от своего антипода физико-химическими методами. При нагревании оставшаяся N-ацил-О-аминокислота рацемизируется, т.е. превращается в исходную смесь, которая вновь подвергается воздействию фермента:

Аминоацилаза строго специфична к структуре только ацильной части субстрата, поэтому одна и та же установка с иммоби­лизованным ферментом используется для получения различных аминокислот, в том числе L-валина, L-метионина, L-фенилаланина и L-триптофана. Время полуинактивации иммобилизованного энзима составляет 65 суток; на японских предприятиях он используется без замены более 8 лет и обеспечивает снижение стоимости производства аминокислот на 40 % по сравнению с тех­нологией, где применяются свободные молекулы фермента.

Получение L-аспарагиновой кислоты. Аспарагиновая кислота широко употребляется в качестве пищевой добавки (подсласти­тель и подкислитель). Первая в мире промышленная установка для синтеза L-аспарагиновой кислоты из получаемого химичес­ким путем фумарата аммония была запущена в 1973 г. в Японии (фирма «Танабе Сейяку»); в ней использованы иммобилизован­ные в полиакриламидном геле клетки кишечной палочки Е. coli, содержащие аспартат-аммиак-лиазу:

Полиакриламидный гель с иммобилизованными микробными клетками формуют в виде кубиков размером 2 — 3 мм, которыми заполняют колонку объемом 1 м3. Через колонку пропускают ра­створ фумарата аммония. При подкислении выходящего из ко­лонки элюата до pH 2,8 и охлаждении до 15 “С из него выкристаллизовывается аспарагиновая кислота в виде препарата 100 %-й чистоты. Процесс получения аспартата полностью автоматизиро­ван и осуществляется в непрерывном режиме. Производительность процесса — 1700 кг чистой аспарагиновой кислоты в сутки на реактор. Иммобилизованные клетки кишечной палочки сохраня­ют активность фермента на 80% в течение 120 дней и на 50% в течение 600 дней работы реактора, в то время как свободные клет­ки — всего на протяжении 10 дней с уровнем активности 25 % от исходной. В Армении был налажен промышленный процесс полу­чения аспартата особой степени чистоты с использованием им­мобилизованной аспартат-аммиак-лиазы на базе научных разра­боток химфака МГУ им. М. В.Ломоносова (1974).

Получение L-аланина. В настоящее время основной промыш­ленный способ получения L-аланина — ферментативное дескарбоксилированис L-аспарагиновой кислоты:

Процесс превращения L-аспартата в L-аланин катализируется аспартат-бета-декарбоксилазой ряда микроорганизмов (Pseudomonas dacunhae, Alcaligenes faccalis, Achromobacter pestifier), иммобилизо­ванных в полиакриламидном геле, каррагинане или полиуретане. Установка, разработанная японской фирмой «Танабе Сейяку», производит этим способом 10 т аланина в месяц. Усовершенство­вание процесса связано с использованием в качестве сырья фумарата аммония. В данном случае процесс получения L-аланина становится двустадийным и реализуется в двух последовательно рас­положенных реакционных колонках. На первом этапе фумарат аммония превращается в L-аспарагиновую кислоту, которая без выделения из реакционной среды на втором этапе претерпевает (5-дскарбоксилирование с образованием аланина.

С помощью иммобилизованных клеток Serratia marcescens из треонина и глюкозы синтезируют L-изолейцин, а с помощью им­мобилизованных клеток Corynebacterium glutamicum — L-глутами­новую кислот>’ из L-глюкозы; L-триптофан — из индола; L-орнитин — из L-аргинина.

Таким образом, расширение производства аминокислот стаю возможным благодаря изменению технологии получения промыш­ленных биокатализаторов и снижению затрат при их производстве.

Получение L-яблочной кислоты. Яблочная кислота — замени­тель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах.

Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты:

В интактных клетках время полуинактивации фумаратгидратазы составляет 6 суток, в иммобилизованных в полиакриламидном геле — 55 суток, а в иммобилизованных в геле на основе каррагинана — 160 суток.

Получение 6-аминопенициллановой кислоты. 6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) — ценное исходное соединение для получе­ния эффективных полусинтетических аналогов природных пенициллинов. Получение 6-АПК в промышленности путем хи­мического гидролиза бензилпенициллина сопряжено с больши­ми трудностями в связи с крайней неустойчивостью лактамного цикла его молекулы. Так, при щелочном гидролизе бензилпени­циллина выход 6-АПК составляет всего 1 %. Продуктивность это­го процесса удалось значительно повысить благодаря примене­нию для гидролиза иммобилизованных бактериальных клеток, со­держащих пенициллинамидазу.

Со второй половины 70-х годов XX в. вся 6-АПК, выпускаемая в России, и значительная часть 6-АПК, получаемая в Италии, производятся с помощью иммобилизованных ферментов. На ита­льянских фирмах применяют фермент, иммобилизованый путем включения клеток Е. coli в волокна триацетата целлюлозы, а на российских предприятиях используют бактериальные клетки, им­мобилизованные в полиакриламидном геле. Переход к техноло­гии, применяющей иммобилизованные бактериальные клетки, обеспечивает высокий выход 6-АПК, составляющий 80 — 85 %. По данным японских исследователей, время полуинактивации пенициллинамидазы, содержащейся в иммобилизованных в полиак­риламидном геле бактериальных клетках, равно 42 суткам при 30 С или 17 суткам при 40 °С.

Внедрение в промышленность биокаталитической технологии производства 6-АПК привело к существенному увеличению выпуска полусинтетических пенициллинов и снижению их себестоимости.

Изложенное далеко не исчерпывает перечень химических про­изводств, базирующихся на использовании иммобилизованных ферментов и клеток. Список ряда биотехнологических процессов с применением иммобилизованных биокатализаторов, разрабо­танных на уровне промышленных и опытных установок, пред­ставлен в табл. 4.3.

Таблица 4.3 Применение иммобилизованных ферментов

4.5. Ферментативная конверсия целлюлозы в глюкозу

В связи со значительным исчерпанием углеводородного сырь насущной проблемой для дальнейшего развития биотехнологи, становится освоение новых сырьевых источников. По существу исчерпаемый и одновременно возобновляемый источник сырь представляет собой растительная биомасса (многолетние растения, вторичные продукты и отходы их промышленной и сельскохозяйственной переработки), основным компонентом которой служит целлюлоза (клетчатка). Ежегодно на Земле создается около 100 млрд т целлюлозы.

Благодаря плотной упаковке линейно построенных полигликозидных цепей целлюлоза устойчива к действию большинств растворителей и химических агентов, в том числе сильных кислот. В природе существуют так называемые целлюлолитические организмы (бактерии, плесневые грибы) и некоторые виды насекомых, содержащие полиферментные комплексы целлюлаз, обепечивающие гидролиз клетчатки до глюкозы. Целлюлазный ком» леке ферментов включает эндо-1,4-бета-глюканазу, экзоцеллобигидролазы, целлобиазы и экзо-1,4-бета-глюкогидролазу, механизм действия которых на клетчатку оказался одинаковым для всех исследованных целлюлазных комплексов независимо от их прохождения. Попадая на целлюлозосодержащие материалы, микорганизмы выделяют целлюлазы, которые, сорбируясь (иммобилизуясь) на субстрате, постепенно расщепляют его до глюкозы. В пос­ледние годы разработаны технологические схемы для непрерывно­го ферментативного гидролиза целлюлозы на уровне опытных установок. Процесс протекает в противоточных реакторах колонного типа, плотно заполненных целлюлозой. Расчеты показывают, что перевод процесса на промышленный уровень обеспечивает полу­чение 24 т глюкозы в сутки. Дальнейшее совершенствование эф­фективности метода конверсии целлюлозосодержащего сырья в глюкозу и далее в этанол и углеводороды позволит создать альтер­нативные пути получения ценных моносахаридов и жидкого топлива из возобновляемого сырья, а также решить еще одну важную про­блему — утилизацию экологически опасных отходов производства.

4.6. Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов

Высокая эффективность биологических катализаторов и спе­цифичность их действия делают ферменты идеальными реагента­ми для аналитической химии. Благодаря этим особенностям с по­мощью ферментов обнаруживаются вещества при предельно низ­кой концентрации в присутствии множества других соединений. К настоящему времени созданы искусственные аналитические системы различных конструкций (биосенсоры, датчики, фермент­ные электроды, проточные анализаторы), содержащие иммоби­лизованные ферменты и клетки и предназначенные для автома­тического детектирования продуктов энзиматического превраще­ния. Например, если использовать иммобилизованную глюкозо- оксидазу, то концентрацию окисляемой кислородом глюкозы определяют, регистрируя количество выделившегося в ходе реак­ции пероксида водорода:

В зависимости от концентрации анализируемых веществ выби­рают тот или иной способ их детекции. Так, количественное со­держание пероксида водорода (ммоль/л) можно определить од­ним из нижеследующих методов:

Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аф­финных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антитело-антиген, агонист (антагонист)-клеточный рецептор, а также на основе полупроводниковых структур и мезоэлектрического эффекта. Последние два биодатчика дают возможность созда­вать сенсоры, чувствительные к газам, что имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменения внеш­них воздействий.

Технологические варианты реакторов с иммобилизованными ферментами весьма разнообразны — колонки, трубки, полые во­локна и пр. С их помощью на практике определяют концентрацию широкого спектра соединений — глюкозы, аминокислот, моче­вины, пенициллина, АТФ, НАДН, ФМН, стероидов, триглицеридов, желчных кислот и многих других (J.Aylott, R. Kopelman, 2000). Так, американскими исследователями сконструирован мик­родатчик на основе глюкозооксидазы и рутениевого красителя, иммобилизованных в полиакриламидной матрице с использованием субмикронных оптических волокон. Микробиосенсор, не вы­зывая повреждений, может быть введен в клетку и даже в отдель­ные ее компартменты для измерения содержания в них глюкозы и кислорода. Предложены датчики на базе иммунодетекции для про­ведения экспресс-анализов на присутствие производных диокси­на (Nomuraet. al., 2000) и оценки содержания биогенных аминов (с помощью моноаминооксидазы) в пищевых продуктах в связи с процессами их старения. Для определения мочевины ферментным электродом требуется всего 30 с.

Биосенсоры на основе иммобилизованных ферментов помога­ют выполнять десятки быстрых и точных анализов при диагности­ке заболеваний, контролировать содержание вредных веществ (ин­сектицидов, пестицидов, удобрений) в пищевых продуктах и в воздухе. Биосенсоры нашли применение в решении аналитичес­ких задач в химической и микробиологической промышленнос­ти, а также в научных исследованиях.

4.7. Иммобилизованные ферменты в медицине

Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромболитические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечно­сосудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу — активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образование тромба в кровеносной системе.

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокисло­ты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокаче­ственным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трип­син, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизован­ные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волок­на, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы — в замести­тельной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Исключительно важны с практической точки зрения работы, посвященные направленному транспорту лекарственных веществ. В этом отношении особенно выгодны инкапсулированные фер­менты типа искусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита («тень эритроцита»), а их содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, перено­сятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому при­меняются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частно­сти саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами с фермен­том, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях народного хозяйства стано­вится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизо­ванных ферментов в корне меняет химическое производство, способы добывания сырья, способствует созданию новых биотехно­логических процессов и методов терапии, совершенствует меди­цинскую диагностику, анализ, органический синтез и оказывает огромное влияние на образ жизни человека.

Источник