Что понимается под разрешающей способностью микроскопа

6.2. Микроскоп

Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.

Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.

6.2.1. Увеличение микроскопа

Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:

,

(6.5)

где – фокусное расстояние микрообъектива, – расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.

Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:

.

(6.6)

Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:

.

(6.7)

Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:

.

(6.8)

Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.

6.2.2. Поле зрения микроскопа

Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра , в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:

.

(6.9)

При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.

6.2.3. Диаметр выходного зрачка микроскопа

Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:

.

(6.10)

где – передняя апертура микроскопа.

Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).

При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.

6.2.4. Разрешающая способность микроскопа

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

.

(6.11)

Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (), то для средней длины волны можно вычислить разрешающую способность микроскопа: .

Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.

Иммерсия

Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (), кедровое масло (), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины , тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит .

Применение ультрафиолетовых лучей

Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны разрешающая способность микроскопа составит .

Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.

6.2.5. Полезное увеличение микроскопа

Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.

Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.

Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии , то угловое расстояние между изображениями этих точек . Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:

.

(6.12)

Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра (0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:

.

(6.13)

Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза ().

Источник

Микроскоп (иммерсия объектива микроскопа)

Микроскоп это оптический прибор для получения (мнимого изображения) его возможность к увеличению ограничивается дифракционными явлениями так они ограничивают полезное увеличение этого микроскопа. Бывают микроскопы: простейшие, медицинские, электронные, измерительные и некоторые другие. Служит средством анализа исследуемой поверхности и как самостоятельная единица не может служить средством измерения, но к примеру связь микроскопа с (вычислительными машинами) используется как средство измерения.

Что такое микроскоп

Оптическая система строения микроскопа состоит из двух линз: объектива и окуляра. Схематизируя явление, можно сказать, что объектив дает промежуточное действительное увеличенное изображение предмета, которое рассматривается в окуляр как в лупу. Окуляр образует еще более увеличенное мнимое изображение, которое воспринимается глазом.

Лучи, исходящие из точек предмета, преломляются в линзе и выходят из нее слегка расходящимся пучком. Вступая в глаз, лучи преломляются в его средах и пересекаются на сетчатой оболочке, образуя действительное изображение предмета, значительно увеличенное по сравнению с тем, которое получилось бы при наблюдении предмета невооруженным глазом.

Окуляр микроскопа образует мнимое изображение, величину которого нельзя непосредственно измерить. Для того чтобы судить о достигаемом при этом увеличении, вводят понятие об угловом увеличении оптического прибора. Угловое увеличение k_уг численно равняется отношению угла зрения β_пр на предмет, когда он рассматривается с помощью оптического прибора, к углу зрения β_гл на этот же предмет при наблюдении его невооруженным глазом:

Угловое увеличение показывает, во сколько раз величина изображения предмета на сетчатке глаза в первом случае больше, чем во втором.

Ход лучей через окуляр микроскопа

Рассмотрим ход лучей через окуляр и глаз при построении изображения от предмета в виде стрелки А Б (рис. 2). Оптический центр глаза совместим с задним главным фокусом окуляра. Тогда луч, исходящий из точки Б и параллельный главной оси линзы, после преломления в ней пройдет через оптический центр О глаза и, не изменяя направления, упадет на сетчатую оболочку глаза в точке Б».

По условиям хода луча эта точка должна быть действительным изображением точки Б предмета. Второй луч из точки Б пройдет через оптический центр О линзы и преломится в оптических средах глаза так, чтобы пересечься с первым лучом в той же точке Б» Точку Б»» глаз относит к точке Б’ мнимого изображения точки Б.

Угол зрения глаза, вооруженного окуляром, есть угол β’. Из ∆O’Оb, принимая во внимание, что Ob = А Б = d, тангенс угла р’ равен отношению величины d предмета к фокусному расстоянию f линзы:

При наблюдении невооруженным глазом предмет располагается на расстоянии наилучшего зрения s. В этом случае тангенс угла зрения β (рис. 2) определится как отношение величины предмета к расстоянию наилучшего зрения:

Тогда угловое увеличение окуляра (по малости углы зрения можно заменить их тангенсами):

Увеличение окуляра

Увеличение окуляра микроскопа равняется отношению расстояния наилучшего зрения (25см) к фокусному расстоянию линзы (точность формулы тем выше, чем меньше фокусное расстояние линзы сравнительно с расстоянием s = 25 см). Окуляр (лупа) может давать увеличение до 15—20 раз.

Увеличение, достигаемое с помощью окуляра, можно определить в следующем опыте (рис. 3). На оптической скамье С, несколько ближе переднего главного фокуса линзы Л, служащей окуляром, помещается достаточно освещенный предмет П, например черная стрелка на белой линейке (или на матовом стекле, освещенном с обратной стороны). Глаз Г располагается вдоль главной оси линзы Л на расстоянии, примерно равном фокусному расстоянию линзы.

Несколько сбоку на оптической скамье на расстоянии s = 25 см от глаза помещают вертикально масштабную линейку М с делениями и нанесенной на нее такой же величины d стрелкой. Затем наблюдают совместно линейку и изображение, которое дает окуляр. Отмечают на линейке отрезок d’, который глазу представляется равным по величине наблюдаемому изображению. Этот отрезок определяется углом зрения, под которым глаз видит мнимое изображение стрелки.

В то же время самой стрелке, нанесенной на линейке, соответствует угол зрения на нее невооруженным глазом. Нетрудно заключить, что отношение величин отрезка d’ и стрелки d будет численно равно угловому увеличению k_ок окуляра:

Увеличение микроскопа

Предмет А Б помещается несколько дальше переднего главного фокуса объектива. При этом плоскость промежуточного изображения А ‘Б’ находится за двойным фокусным расстоянием объектива. Окуляр Ok располагается так, чтобы эта плоскость была не сколько ближе к линзе, чем передний главный фокус окуляра.

Ход лучей через окуляр и глаз может быть построен упрощенно в соответствии с рис, 2, при этом промежуточное изображение А’ Б ‘ рассматривается как предмет, расположенный перед окуляром. Таким путем находятся точки Б»’ изображения на сетчатке и Б» — мнимого изображения. Если при этом желательно показать также и действительный ход лучей, образовавших точку Б’ промежуточного изображения, то из точки Б» проводятся линии Б»а и Б»b к точкам а и b пересечения продолжения лучей с главной плоскостью окуляра. Дальше лучи строятся как продолжение этих линий до пересечения с главной плоскостью глаза, а затем непосредственно к точке Б»’.

Покажем это построение по правилам. Через оптический центр О’ окуляра проводятся побочные оси, параллельные этим лучам до пересечения в точках с и d с фокальной плоскостью MN окуляра, в данном случае совпадающей с главной плоскостью глаза.

Рассматриваемые лучи проходят через эти точки как через фокусы. Дальнейший ход этих лучей определится аналогично путем построения параллельных им побочных осей через оптический центр О глаза до пересечения с фокальной плоскостью Ф_гл глаза и т. д.

Угловое увеличение микроскопа k_м численно равняется произведению линейного увеличения объектива k_об и углового увеличения окуляра k_ок: k_м = k_об • k_ок.

Линейное увеличение линзы, как указывалось, k = b/a. Применяя эту формулу к объективу микроскопа, можно считать расстояние а от предмета до объектива равным фокусному расстоянию объектива: а = f₁. Расстояние от объектива до изображения равняется сумме фокусного расстояния объектива f₁ и так называемой оптической длины тубуса L₀ (расстояние между задним главным фокусом объектива и передним главным фокусом окуляра):

или, пренебрегая фокусным расстоянием объектива по сравнению с оптической длиной тубуса (последняя обычно в десятки раз больше): b ≈ L₀. Тогда увеличение объектива:

Увеличение микроскопа равняется отношению произведения оптической длины тубуса на расстояние наилучшего зрения к произведению фокусных расстояний объектива и окуляра.

Увеличение объектива и окуляра называется их собственным увеличением и указывается на оправе линз.

Свойства микроскопа

Свойства простейшего микроскопа с небольшим увеличением можно изучить на модели, подобной модели (рис. 3), которая дополнена второй линзой — объективом. Перед объективом на соответствующем расстоянии располагается наблюдаемый предмет.

Разрешающая способность микроскопа

Соответствующим подбором линз можно обеспечить весьма большое увеличение оптического микроскопа (несколько тысяч раз), однако это может быть бесполезно, так как возможность различения мелких деталей предмета ограничивается дифракционными явлениями. Эти явления ограничивают полезное увеличение микроскопа и учитываются с помощью понятия о его разрешающей способности.

При прохождении света через мельчайшие детали предмета происходит дифракция, в результате которой при определенных условиях изображение этих деталей может терять резкость контуров, может иметь место нарушение подобия изображения предмету и, наконец, изображение может вообще не получиться. Поэтому, например, в оптическом микроскопе нельзя увидеть фильтрующиеся вирусы, отдельные белковые молекулы и т. п.

Свойства оптической системы давать изображение достаточно мелких объектов без нарушения подобия их предмету называют разрешающей спо собностью системы. Разрешающая способность характеризуется пределом разрешения или наименьшим расстоянием между двумя светящимися (или освещенными) точками, изображение которых в данной оптической системе наблюдается раздельно. Чем меньше предел разрешения z, тем выше разрешающая способность оптического прибора. Применяя это к микроскопированию биологических объектов, можно считать, что предел разрешения обусловливает наименьшую величи ну тек структурных деталей которые могут различаться в препарате.

Теория разрешения микроскопа

Теория разрешающей способности микроскопа разработана Э. Аббе, а затем советскими физиками Л. И. Мандельштамом и Д. С. Рождественским. Выводами этой теории и пользуются на практике. Для лучшего понимания этих выводов и особенно для выяснения значения апертурного угла объектива для разрешающей способности микроскопа, рассмотрим этот вопрос предварительно в более упрощенной форме.

Рассмотрим образование с помощью объектива изображения светящегося отверстия S достаточно малого диаметра d, на которое падает пучок параллельных монохроматических лучей (рис. 4). Проходя через отверстие, свет испытывает дифракцию и лучи его отклоняются в стороны. Объектив собирает отклонившиеся лучи и в сопряженной плоскости образует изображение отверстия.

При этом можно рассмотреть два случая. Первый, когда апертурный угол объектива ϴ больше угла α дифракции лучей, тогда все дифрагировавшие лучи собираются объективом и принимают участие в образовании изображения (рис. 4, а). В этом случае оно будет геометрически во всем подобно предмету. Второй случай, когда апертурный угол ϴ объектива меньше угла а дифракции лучей, тогда не все исходящие из отверстия лучи собираются объективом и принимают участие в образовании изображения (рис. 4, б). В этом случае можно ожидать, что изображение не будет полностью геометрически подобно предмету. Степень нарушения подобия будет зависеть от того, какая часть дифрагировавших лучей не примет участия в образовании изображения.

Для того чтобы все отклонившиеся лучи были собраны объективом, необходимо чтобы его апертурный угол ϴ был не меньше угла а дифракции или в пределе был ему равен:

ϴ = α.

Угол а отклонения лучей при дифракции тем больше, чем больше длина волны λ и чем меньше диаметр d отверстия. Допустим для наших упрощенных рассуждений, что между величинами α и λ существует прямая и между α и d обратная пропорциональность, т. е. α ≈ λ/d.

Посмотрим, какой вид примут эти соотношения в случае наклонного падения лучей на отверстие. Угол наклона лучей сделаем равным апертурному углу. Будем считать достаточным условием для сохранения подобия между изображением и предметом попадания в объектив всех дифрагировавших лучей хотя бы по одну сторону от первоначального направления. При этом, как видно из рисунка, необходимо, чтобы апертурный угол ϴ был не меньше половины угла α дифракции:

ϴ = α/2;

Тогда аналогично предыдущему можно получить соотношение d ≈ λ/2ϴ.

Следовательно, в данном случае условия разрешения улучшаются.

Перенося наши рассуждения на условия микроскопирования, можно считать, что диаметр d отверстия соответствует наименьшей величине структурных деталей препарата, т. е. принять его за предел разрешения микроскопа d = z. Тогда можно сказать, что предел разрешения будет тем мень ше, чем короче длина волны λ света и чем больше апертурный угол в объектива, с помощью которого образуется изображение. При прямом падении лучей z ≈ λ/ϴ и при наклонном (под углом равным ϴ) падении лучей

За фокальной плоскостью лучи, идущие от максимумов различного порядка, опять расходятся, интерферируют между собой и, падая на экран Э, расположенный в сопряженной плоскости, дают изображение решетки. Если в этом участвуют лучи от всех максимумов, изображение решетки будет достаточно резким.

Если задержать лучи от максимумов высших порядков, то изображение решетки потеряет в резкости, но может быть еще приемлемым, если в нем различаются отдельные щели, т. е. выполняется условие их разрешения. Согласно теории Аббе для этого необходимо, чтобы в образовании изображения решетки участвовали лучи не меньше, чем от нулевого максимума и максимума первого порядка, хотя бы с одной стороны. Если задержать лучи от всех максимумов, кроме нулевого, то изображения не получится, так как на экран будут падать прямые, не пересекающиеся между собой лучи, которые создадут только равномерную освещенность экрана.

Пример разрешения микроскопа

Указанные явления можно показать на опыте. Спроектируем при помощи объектива Л на экран Э изображение сетки С из тонких вертикальных проволок (сетка в данном случае служит дифракционной решеткой), осветив ее с помощью конденсора К сходящимся пучком света ( при наклонном падении лучей, которое дает сходящийся пучок, дифракцию света можно наблюдать на более грубых объектах).

Поместим в фокальной плоскости объектива параллельно вертикальным проволокам сетки щелевую диафрагму Д и будем постепенно суживать ее щель. При этом диафрагма будет ограничивать количество дифракционных максимумов, лучи от которых участвуют в изображении вертикальных проволок сетки (горизонтальных проволок, оставленных для контроля по сторонам сетки, это касаться не будет).

Вначале изображение сетки только теряет в яркости. При достаточном сужении щели изображение теряет резкость, но проволоки в нем еще разрешены, при еще большем сужении щели изображение проволок бледнеет, расплывается и, наконец, исчезает.

Такие же результаты можно получить, если вместо задержания лучей от боковых максимумов с помощью диафрагмы ограничить доступ в линзу лучей, образующих эти максимумы, путем сужения апертурного угла объектива.

Для разрешения щелей в изображении дифракционной решетки па теории Аббе необходимо, чтобы в образовании ее изображения участвовали лучи от максимумов нулевого и первого порядка. Для этого направления лучей, образующих эти максимумы, должны лежать в пределах апертурного угла объектива. Другими словами, апертурный угол объектива ϴ должен быть больше или в пределе, равен углу а₄ отклонения лучей, образующих максимум 1-го порядка:

Предел разрешения в этом случае может быть приравнен периоду решетки: z = d.

Тогда, используя формулу дифракционной решетки d = —— и подставляя в нее указанные величины, получим

Предел разрешения численно равен отношению длины волны света к синусу апертурного угла объектива.

Это — в случае перпендикулярного падения света на предмет, что имеет место только в простейших микроскопах. В более совершенных микроскопах предмет освещается сходящимся пучком лучей, образуемым с помощью конденсора К . При этом вследствие концентрации света на небольшом участке предмета значительно повышается яркость изображения, а в связи с наклонным падением лучей улучшаются условия разрешения.

При падении лучей на дифракционную решетку под углом φ направление на максимум первого порядка обусловлено выражением:

Используя эту формулу в теории Аббе, надо заменить угол дифракции α’₁ на апертурный угол ϴ, принять во внимание, что угол падения лучей φ также равен апертурному углу ϴ и приравнять период решетки d пределу разрешения z. В результате получим:

Предел разрешения объектива при наклонном освещении предмета численно равен отношению длины волны света к удвоенному синусу апертурного угла объектива.

Иммерсия объектива

Дальнейшим усовершенствованием микроскопа явилось применение иммерсии объектива. Иммерсия еще больше повышает яркость изображения и улучшает разрешающую способность объектива.

Иммерсия заключается в том, что между предметом и объективом помещается капля жидкости, показатель преломления которой близок к показателю преломления стекла. Например, глицерина ( п = 1,45), кедрового масла ( п = 1,51) или монобромнафталина ( п = 1,66). Ход световых лучей сравнительно в простом (сухом) и в иммерсионном объективах показан на рис. 5, на котором обозначено: П — препарат, С — покровное стекло, И — иммерсионная среда, О — фронтальная линза объектива и К — конденсор. При наличии между покровным стеклом и объективом воздуха лучи, падающие на препарат под углом, большим предельного р, испытывают на границе стекла и воздуха полное внутреннее отражение (рис. 5, а); отражение лучей происходит также и от наружной поверхности объектива.

В иммерсионном объективе свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не испытывает отражения (рис. 5, б). Это значительно повышает яркость изображения, что имеет существенное значение для микроскопа с большим увеличением. Например, для микроскопа с увеличением в 400 раз площадь изображения по сравнению с площадью предмета увеличивается в 160 000 раз, во столько же раз уменьшается его яркость по сравнению с яркостью предмета.

где λ—длина вол ны света в воздухе. Подставляя эти данные в формулу для предела разре шения, получим:

т.е. предел разрешения иммерсионного объектива при наклонном освещении предмета численно равен отношению длины волны света к удвоенному произведению показателя преломления иммерсионной среды на синус апертурного угла объектива.

Величина А = sin θ для сухого или А _п = n sin θ для иммерсионного объектива называется числовой апертурой и для сухого объектива обозначается на его оправе вместе с увеличением. Учитывая это, можно сказать, что предел разрешения микроскопа равняется длине волны света, при котором производится наблюдение, деленной на числовую апертуру при перпендикулярном падении света на предмет z = λ/A, или деленной на удвоенную числовую апертуру при наклонном освещении z = λ/2A

Тогда при освещении предмета белым светом, считая X = 0,555 мк (длина волны, к которой глаз наиболее чувствите лен), предел разрешения для сухого микроскопа при прямом освещении z ≈ 0,5 мк, при наклонном освещении z ≈ 0,3 мк и для иммерсионного объектива z ≈ 0,2 мк.

Дальнейшее повышение разрешающей способности оптического микроскопа может быть достигнуто только путем уменьшения длины волны света, с помощью которого производится исследование, например, путем применения ультрафиолетового излучения и фотографирования наблюдаемых объектов. Для этого имеются специальные микроскопы с кварцевой оптикой.

Статья на тему Микроскоп

Похожие страницы:

Понравилась статья поделись ей

Источник