Что прибавляют к собранному материалу для подавления роста грамположительных кокков

Что прибавляют к собранному материалу для подавления роста грамположительных кокков

Глава 16. Менингококки

Род Neisseria включает два вида микробов, патогенных для человека: N. meningitidis и N. gonorrhoeae. Neisseria meningitidis были выделены из цереброспинальной жидкости больного Вексельбаумом (1887).

На плотных питательных средах менингококки образуют небольшие 2-3 мм в диаметре, нежные, полупрозрачные, голубоватые, вязкие колонии. В бульоне с сывороткой менингококки дают легкую муть и небольшой осадок. Свежевыделенные штаммы в S-форме. Старые культуры могут диссоциировать, образовывать шероховатые R-формы колоний.

Ферментативные свойства. Биохимически менингококки мало активны. Они расщепляют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Протеолитические свойства у них не выражены (не створаживают молоко, желатин не разжижают).

Патогенность менингококков обусловливается наличием капсулы, которая препятствует фагоцитозу, пи лей, способствующих прикреплению микроба к поверхности эпителиальных клеток, и образованием ферментов: гиалуронидазы и нейраминидазы.

Токсинообразование. При разрушении бактериальных клеток высвобождается сильный термоустойчивый эндотоксин, который является липополисахаридом клеточной стенки. При заболевании он обнаруживается в крови и в спинномозговой жидкости больных. Тяжесть заболевания часто зависит от количества накопившегося токсина.

Антигенная структура. По полисахаридному (капсульному) антигену менингококки разделяют на серогруппы: А, В, С, D, X, Y U-135 29E (всего девять серогрупп).

Согласно международной классификации основными группами являются А, В и С. Менингококки группы А часто вызывают генерализованные процессы и имеют наибольшее эпидемиологическое значение. Менингококки групп В и С вызывают спорадические заболевания. Остальные серогруппы мало изучены.

Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их быстро.

Восприимчивость животных. В естественных условиях животные не чувствительны к менингококкам. Но при субдуральном введении менингококков обезьянам можно вызвать у них заболевание.

Внутрибрюшинное заражение морских свинок и белых мышей вызывает их гибель за счет действия эндотоксина.

Источники инфекции. Больной человек и бактерионоситель.

Пути передачи. Основной путь воздушно-капельный.

Заболевания у человека:

3) цереброспинальный эпидемический менингит.

Иммунитет. Постинфекционный иммунитет напряженный, он обусловливается опсонинами, комплементсвязывающими и бактериоцидными антителами. От интенсивности образования антител к полисахаридным и белковым антигенам зависит течение заболевания.

Профилактика. Сводится к раннему выявлению носителей, изоляции заболевших назофарингитом. Больные подлежат госпитализации.

Специфическая профилактика. Разработана химическая вакцина, состоящая из полисахаридов серогрупп А и С. Для экстренной профилактики используется иммуноглобулин.

Контрольные вопросы

1. Каковы морфологические свойства менингококков?

2. На каких средах выращивают менингококки и какие условия необходимы для их размножения?

3. Какова биохимическая активность менингококков и их устойчивость во внешней среде?

4. Какие заболевания вызывают менингококки?

5. По какому антигену делят менингококки на серогруппы?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление менингококка и определение его серогруппы.

1. Спинномозговая жидкость.

2. Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.

Способы сбора материала

Ход исследования

Производят учет результатов (табл. 27)

Таблица 27. Дифференциация менингококков от непатогенных нейссерий

Определение группы менингококка. После получения чистой культуры менингококка проводят серологическое определение группы. Для этого используют коммерческие агглютинирующие и преципитирующие сыворотки.

На предметное стекло наносят по одной капле неразведенных агглютинирующих сывороток групп А, В, С и др., каплю изотонического раствора натрия хлорида (контроль). К каждой капле прибавляют одну петлю выделенной культуры. Наличие агглютинации в одной из капель определяет группу выделенной культуры.

Для выявления серогрупп можно ставить реакцию преципитации в геле (см. главу 32).

В настоящее время с диагностической целью используют серологические методы диагностики: сыворотку обследуемых лиц исследуют в РНГА с менингококковым эритроцитарным диагностикумом А, С и других серогрупп.

1. Какой материал служит для выявления менингококков при заболевании менингитом?

2. Как транспортируют исследуемый материал?

3. Что прибавляют к собранному материалу для подавления роста грамположительных кокков?

4. От каких микроорганизмов необходимо дифференцировать менингококки, какие методы исследования проводят для дифференциации?

5. Какую реакцию ставят для определения серогруппы менингококков?

1. Подготовьте тампон, изогните его под углом 135° и возьмите друг у друга слизь из носоглотки. Посейте ее на агар с сывороткой.

2. Изучите под микроскопом мазок из культуры менингококка и зарисуйте его.

Агар с сывороткой (см. главу 7).

Среда с линкомицином. К 80 мл расплавленного и остуженного до температуры 50° С 2% агара добавляют 20 мл лошадиной или бычьей сыворотки, 0,5-0,7 мл раствора линкомицина в рабочем разведении (рабочее разведение 0,001 мг на 1 мл среды). После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Раствор линкомицина готовят на стерильной воде и сохраняют в холодильнике.

Источник

Тот случай, когда встречают и провожают по одежке

Разнообразие форм клеток прокариот не является (по крайней мере не всегда) случайным феноменом эволюции этих организмов. Исследования показали, что форма бактерий может быть обусловлена физическими законами среды обитания: в вязкой среде эффективнее перемещаются микрообитатели спиральные формы, а следовать направлению лучше могут изогнутые вибрионы и т.д. Согласно расчетам наиболее удобна для микроскопических одноклеточных прокариот форма палочек, которые благодаря своей форме могут противостоять броуновскому движению в жидкостях, имеют эффективное соотношение поверхности к объему клетки и могут закрепляться на субстрате…Авторы статьи проанализировали исследования эволюции и связи с экологией формы клеток бактерий.

Форма и размер бактериальных клеток, как и свойства их клеточной стенки (что отразилось на широко известном делении бактерий на грамположительных и грамотрицательных) – одни из самых первых признаков, использованных для классификации этих организмов. Разнообразие форм клеток и в то же время постоянство формы клеток на видовом уровне (за некоторым обсуждаемом ниже исключением) позволили довольно подробно и точно определять таксономическую принадлежность бактерий. Однако причины возникновения разнообразия формы и ее стабильность внутри разного уровня таксонов прокариот долго оставались загадкой. Новые методы исследований – электронная микроскопия, методы молекулярной биологии и биохимии, а также исследования физических закономерностей и математическое моделирование помогли установить ряд факторов, определяющих внешнее строение бактерий. В обсуждаемой статье авторы представили анализ исследований связи формы клеток бактерий с их экологией и эволюцией.

Несмотря на то, что основными являются три типа клеток бактерий (заглавная иллюстрация) – сферическая, палочковидная и спиральная – специалисты выделяют довольно большое разнообразие других форм (рис. 1). Известно, что бактерии по строению клеточной стенки можно разделить на два типа (рис. 1, 2). Строение оболочки (клеточной стенки бактерий) в значительной степени связано с ее формой. Среди определяющих форму бактерий факторов на данным момент выделяют несколько основных:
— наличие/отсутствие внешней мембраны (у грамотрицательных бактерий);
— относительная толщина пептидогликанового слоя;
— особенности строения продольных пептидных сшивок между гликановыми нитями, ориентированными перпендикулярно длинной оси клетки: у грамотрицательных образуются напрямую, а у грамположительных через дополнительный мостик.

Ряд авторов отмечают, что морфологическое разнообразие грамотрицательных бактерий выше, чем таковое грамположительных (см. рис. 1). Среди грамположительных бактерий преобладают палочки, часто встречаются кокки и нитевидные формы, а вот изогнутые и спиральные формы очень редки. Палочки также преобладают и среди грамотрицательных бактерий, но второе и третье места по распространенности делят изогнутые и спиральные формы. А вот кокки и одноклеточные нитчатые формы среди грамотрицательных бактерий редки, хотя некоторые палочки и спиральные бактерии в определенных условиях могут приобретать округлую форму, например, в стационарной фазе культивирования и при неблагоприятных условиях.

На настоящий момент превалирует представление, что белки цитоскелета, такие как MreB (Murein cluster B) и FtsZ (Filamenting temperature-sensitive mutant Z) гомологи актина и тубулина эукариот, не являются собственно архитектурными элементами формы клеток, а представляют собой нечто похожее на разметку для активации процессов синтеза/разборки клеточной стенки, являясь сайтами прикрепления соответствующих ферментов и регуляторных белков. Экспериментально было показано, что присутствие белка MreB отвечает за палочкообразную форму клетки, а белок FtsZ отвечает за формирование перегородки и других структур во время деления клетки (так называемое Z-кольцо). Представляется, что белок MreB это основной фактор формирования палочковидной формы: он организует в определенных местах клеточной стенки (там, где будут «стенки палочки») синтез пептидогликана (клеточной стенки) после разделения клетки на дочерние и, таким образом, обеспечивает удлинение клеток. У кокков (сферическая форма) этого белка нет, а наращивание клеточной стенки происходит в кольцевой зоне при делении клетки за счет белка FtsZ и других белков, участвующих в делении клетки. Для объяснения формы клеток прокариот еще одним важным белком считается кресцетин CreS. Его наличие в определенной области затормаживает образование клеточной стенки, что приводит к искривлению клетки в результате неравномерного роста. Так могут получаться изогнутые формы. Есть и другие белки-кандидаты (например, бактофилины), претендующие на роль в процессе формообразования у прокариот, однако их функции пока изучены недостаточно.

Кокки. Можно выделить два типа прокариот, имеющих сферическую форму. Одни кокки («собственно» кокки) в течение всего жизненного цикла остаются сферическими. Другие («производные» кокки) – палочки, вибрионы, и др.- приобретают сферическую форму только в неблагоприятных условиях. Как уже говорилось, у подавляющего большинства «собственно» кокков не обнаружен белок MreB (ответственный за палочковидную форму) и сферическая форма приобретается в ходе процессов роста дочерних клеток в зоне деления материнской клетки. «Производные» кокки получают свою сферическую форму другим путем: за счет, так называемого, «редуктивного» деления, когда многократные деления клеток не перемежаются синтезом клеточной стенки в районе стенок (т.е. удлинением). Очевидно, напрашивается вывод, что кокки произошли от палочковидных бактерий в результате потери основного белка MreB, обеспечивающего удлинение стенок.

Чем же выгодно быть сферическим? У сферической формы наименьшее соотношение площади поверхности к объему, это объясняет их малые размеры, потому кокки являются доминирующей группой в микропорах различных типов почв. Это же свойство выгодно при переживании неблагоприятных условий в случае с «производными» кокками. Поскольку шарообразная форма наименее удобна для управляемого движения, кокки, как правило, лишены «органов движения», например, жгутиков. Показано, что сферическая форма позволяет бактериям быстрее распространяться пассивно с током воды, чем бактериям других форм. Эта закономерность объясняет «любовь» кокков образовывать скопления (диплококки – две клетки, стрептококки – нити клеток, стафилококки – гроздья клеток), которые затормаживают пассивное передвижение, а при необходимости агрегация распадается под действием специальных ферментов, разделяющих склеенные между собой клетки (рис. 3).

Палочки. По-видимому, самая удобная (универсальная) для бактерий форма клеток. Большинство исследователей считает палочки исходной в эволюционном плане формой. Подсчитано, что клетки с соотношением длины к диаметру (l/d) около 3.7 испытывают наименьшее сопротивление среды при активном передвижении в жидких средах, более того выгоднее быть длиннее, чем короче, данного соотношения: чтобы испытывать такое же сопротивление среды, как кокки, палочки должны стать в 130 раз длиннее своего диаметра. При соотношении l/d от 3 до 6 наблюдается наибольшая эффективность поглощения питательных веществ из окружающей среды и их внутриклеточного транспорта. Именно таким формам удобно закрепляться на субстрате. Замечено, что очень успешно палочки «собираются» в (печально известные) биопленки.

Многочисленные нитевидные формы это производные палочек, длина стенок которых во много раз превышает диаметр клетки. Нитевидная форма одна из стратегий избегания хищничества со стороны простейших. Длинные, разветвленные формы получают возможность функционально дифференцировать клетку, что способствует более эффективному питанию в случае дефицита определенных элементов питания.

Извитые (спиральные) формы. Бактерии могут становится извитыми разными способами в разных эволюционных линиях прокариот. Например, Helicobacter pylori, вызывающий язву желудка, особыми ферментами (группы Csd) контролируемо разрезает сшивки между нитями в пептидогликановом слое, благодаря чему правильно организованный цилиндр клеточной стенки скручивается в спираль (рис. 4). Интересно, что грамположительные бактерии не имеют ферментов этой группы, к тому же их сшивки между нитями содержат дополнительные (пентаглициновые) мостики, а не сшиты напрямую, как у грамотрицательных бактерий. Эти обстоятельства в некоторой степени объясняют редкость спиральных форм среди грамположительных бактерий.

По-видимому, другой способ скручиваться изобрели Spirochaetae. Сначала было подозрение, что имеющиеся у спирохет жгутики, расположенные в внутреннем пространстве между мембранами (см. рис. 2, межмембранное пространство), ответственны за скручивание клеток. Действительно, было показано, что извитые формы спирохет в виде плоской волны «используют гены» внутренних жгутиков для образования стяжек в нужных местах для придания волнообразной формы клетке. Однако полученные правильно скрученные спиральные мутантные формы без внутренних жгутиков показали, что спиральные спирохеты используют еще какой-то механизм для скручивания. Представляется, что спиральные формы более эффективны при движении в вязкой среде, чем другие формы бактерий.

Изогнутые формы– вибрионы – можно рассматривать как короткие спиральные формы. Но у вибрионов есть покрайней мере еще один способ изогнуться: при помощи «тормозящего» белка кресцетина CreS (см. выше). Ряд исследований показал, что изогнутая форма вибриона способствует активному движению в жидкости и активному поиску лучшего места (хемотаксису).

Помимо общей формы клетки бактерии также могут иметь дополнительные внешние морфологические элементы – жгутики, мембраны, выросты, ножки – отражающие способности прокариот специфически приспосабливаться к определенным условиям жизни, моделируя для себя субнишевые (в экологическом смысле) пространства (рис. 5). Понятно, что целый ряд факторов, таких как свойства среды, способ питания, хищничество со стороны простейших, взаимодействие с субстратом и др. определяют эволюцию формы клеток бактерий. Интересно, что один и тот же тип клеток, как и дополнительных внешних морфологических приспособлений, может обеспечиваться разными структурными элементами оболочки и молекулярными механизмами в ходе эволюции разных таксонов.

Источник

Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов

УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
4 марта 2004 года

4.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.1887-04

1. Разработаны: Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Минздрава России (И.С.Королева, Г.В.Белошицкий, Л.В.Спирихина, А.М.Грачева, И.М.Закроева), Центром госсанэпиднадзора в г. Москве (Н.Н.Филатов, Г.Г.Чистякова), Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (Г.Ф.Лазикова, Н.А.Кошкина, З.С.Середа).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 4 марта 2004 года.

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях изложены организационные и методологические принципы лабораторной диагностики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы и здравоохранения.

Локализация очага воспаления, а так же характерные для этих заболеваний тяжелейшие клинические проявления и генерализация процесса с поражением различных органов и тканей указывает на необходимость быстрого решения вопроса об этиологии заболевания и назначения адекватной антибактериальной терапии, которая неоднозначна для гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) разной этиологии.

От грамотного и своевременного проведения исследований по определению этиологического агента заболевания и как можно более раннего начала соответствующего этиотропного лечения зависит исход заболевания, показатели летальности, число и тяжесть постинфекционных осложнений.

Данные лабораторной диагностики бактериальных менингитов и изучение основных биологических свойств у возбудителей лежат в основе определения прогностических критериев в системе эпидемиологического надзора за бактериальными менингитами, в том числе и генерализованными формами менингококковой инфекции (ГФМИ).

Необходимо учитывать, что одним из проявлений ГФМИ является распространенная клиническая форма «менингококковый менингит» без менингококкцемии, при которой точный клинический диагноз без проведения лабораторных исследований поставить невозможно.

Рационально организованная, комплексная, лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов любой этиологии позволяет достоверно контролировать состояние проблемы этой инфекционной патологии.

3. Эпидемиологические особенности менингококковой
инфекции и гнойных бактериальных менингитов

Заболевание наиболее часто встречается в первые два года жизни, хотя известно, что бактериальный менингит может развиться в любом возрасте. Этиологическими агентами являются менингококки, пневмококки, гемофильные палочки, стафилококки, энтеробактерии, стрептококки, листерии и другие микроорганизмы. Наиболее значимыми возбудителями признаны менингококки, пневмококки и гемофильные палочки типа «b», отвечающие за более чем 90% случаев от числа всех расшифрованных ГБМ. Следует подчеркнуть важную роль и «прочих» микроорганизмов, особенно в этиологии бактериальных менингитов у новорожденных. Клиническая и лабораторная дифференциальная диагностика синдрома менингита должна включать и учитывать большой спектр заболеваний, таких как туберкулезный менингит, малярия, ряд энцефалитов, способных давать похожую на бактериальный менингит клиническую картину.

Среди гнойных бактериальных менингитов генерализованные формы менингококковой инфекции вызывают наибольшую озабоченность в мире из-за периодически возникающих пандемий, эпидемий, эпидемических подъемов заболеваемости и вспышек.

Район субсахарной Африки от Эфиопии с востока до Гамбии с запада и включающий 15 стран и более 260 млн. человек известен как «менингитный пояс». Там регистрируют высокие показатели заболеваемости менингококковой инфекции (МИ), обусловленной менингококками серогруппы А (показатели достигают 1000 на 100 тыс. населения в период эпидемий и 100 на 100 тыс. в межэпидемический период). В обзорах по менингиту в Африке отмечается связь эпидемических подъемов заболеваемости с засушливым периодом года, когда наиболее высока вероятность нарушения целостности слизистой оболочки носоглотки, способствующей проникновению менингококков в кровоток. Эпидемии встречаются не только на Африканском континенте. Известны крупные вспышки в Бразилии и на Кубе (70-е годы), Иране и Ираке (60-е годы), Монголии (начало 70-х годов), Российской Федерации (начало 70-х годов) Непале и Индии (середина 80-х годов). По-прежнему высока заболеваемость МИ среди аборигенов Австралии и во многих странах Европейского континента. Так, в последние годы была зарегистрирована эпидемия менингококковой инфекции, вызванная менингококками серогруппы В в Новой Зеландии с показателем заболеваемости более 11 на 100 тыс. населения. Большую озабоченность у мировой медицинской общественности вызывает эпидемиологическая ситуация в Саудовской Аравии, в ряде арабских стран, а так же за пределами этого региона в связи с постоянно возникающими эпидемиями МИ среди паломников в Мекку (август-сентябрь 1987 года, март-май 2000 года).

В рамках официальной государственной статистической отчетности в Российской Федерации регистрируют только менингококковую инфекцию. Заболеваемость менингококковой инфекцией в Российской Федерации в 1998-2002 годы носила стабильный характер, и показатели ее составляли в среднем 2,7 на 100 тыс. населения. В 2003 году отмечен рост заболеваемости МИ по сравнению с 2002 годом на 8,3%, показатель заболеваемости составил 3,01 на 100 тыс. населения (таблица 1).

Заболеваемость менингококковой инфекцией
в Российской Федерации за 1998-2003 годы
(на 100 тыс. населения)

Важным параметром эпидемиологического надзора за МИ является изучение серогрупповой характеристики менингококков, выделенных из ликвора и крови больных генерализованными формами менингококковой инфекции. По данным Российского Центра по эпидемиологическому надзору за менингококковой инфекцией и гнойными бактериальными менингитами за 2002 год в серогрупповой характеристике менингококков почти в равных соотношениях выявлены менингококки серогруппы A (38,2%) и B (36,6%). Доля менингококков серогруппы С составила 24,6%. На другие серогруппы менингококков и негруппируемые штаммы приходилось 0,5% (таблица 2).

По обобщенным данным за 2003 год отмечалось некоторое преобладание менингококков серогруппы A (35%), а доля менингококков серогруппы B и C составила 31% и 17,8% соответственно. На редкие серогруппы менингококков приходилось 1,1%, а доля неагглютинирующихся штаммов составила 15,1%.

Выявленные показатели серогруппового пейзажа менингококков за период 2003 года различались по территориальным округам Российской Федерации. Так, в Южном и Центральном Федеральных округах выявлено преобладание менингококков серогруппы A (52,8% и 44,9% соответственно). В других округах распространение эпидемиологически опасной серогруппы A было незначительным и колебалось от 3% (Северо-Западный Федеральный округ) до 9,5% (Дальневосточный Федеральный округ). Вместе с тем в Северо-Западном, Дальневосточном и Сибирском Федеральных округах значительно преобладали менингококки серогруппы В (66,7%, 52,4% и 48,9% соответственно). Наименьшим территориальным колебаниям было подвержено распространение менингококков серогруппы C, при этом их удельный вес составил в среднем 17,8% с ранжированным интервалом колебаний от 14,6% (Южный Федеральный округ) до 37,9% (Уральский Федеральный округ).

Генерализованными формами менингококковой инфекции чаще болеют дети (до 70% от общего числа зарегистрированных случаев), при этом следует отметить возможность заражения менингококковой инфекцией во всех возрастных категориях. Общий показатель летальности при ГФМИ определен как высокий и составляет в среднем 9-11%.

Микробиологическое подтверждение ГФМИ и изучение биологических свойств менингококков, выделенных от больных (из крови и ликвора), является необходимой составляющей для формирования системы эпидемиологического надзора и выявления особенностей течения эпидемического процесса МИ на определенной территории. Выявление эпидемиологических параметров позволяет оценивать эпидемиологическую обстановку и определять тактику вакцинопрофилактики. В Российской Федерации разрешены для применения и используются полисахаридные вакцины, способные защитить от заболеваний, вызываемых менингококками серогруппы A и серогруппы C.

Заболевания, вызываемые Hib, распространены повсеместно и входят в блок детских инфекций. Hib-возбудитель вызывает большой спектр гнойно-септических воспалений: менингит, пневмония, эпиглотит, остеомиелит, перикардит, артрит и другие. В этиологической структуре бактериальных менингитов среди детей Hib-возбудитель занимает второе место после менингококков. В отличие от других бактериальных менингитов Hib-менингиты встречаются почти исключительно среди детей раннего возраста: 80-95% Hib-менингитов приходится на возраст до 5 лет. Заболевание не носит различий, связанных с полом: в равной степени болеют лица как женского, так и мужского пола. Внутригодовая сезонность не имеет выраженного характера, но наблюдается возрастание числа случаев заболеваний весной и осенью. Летальность составляет 3-6% и оценивается как высокая. В этой связи Hib-менингиты относят к категории опасных инфекционных заболеваний детского возраста. Применение разрешенных в Российской Федерации вакцинных препаратов защищает от возникновения Hib-заболеваний.

Инфекционные заболевания пневмококковой этиологии являются актуальной проблемой практического здравоохранения, что обусловлено ведущей ролью S.pneumoniae (пневмококка) в структуре инфекций дыхательных путей, особенно внебольничных пневмоний, отитов, синуситов, бактериальных менингитов, в более редких случаях, как возбудителя эндокардитов, септических артритов, флегмон и других заболеваний.

В результате попадания пневмококков в кровоток и центральную нервную систему, возбудитель вызывает инвазивную инфекцию в виде бактериемии и менингита. Генерализация процесса обусловлена низким уровнем специфического и неспецифического иммунитета, и вирулентными свойствами возбудителя.

Менингиты пневмококковой этиологии занимают второе место в этиологической структуре бактериальных менингитов, уступая только генерализованным формам менингококковой инфекции. Они отличаются тяжелым и осложненным течением, часто требующим проведения интенсивных терапевтических и реанимационных мероприятий, высокими показателями летальности, развитием резидуальных явлений, нередко приводящим к тяжелой инвалидизации больных. От 50% до 80% больных при поступлении в стационар направляются в реанимационные отделения. Летальность среди детей до года и лиц пожилого возраста старше 65 лет достигает от 40% до 70%. Более трети переболевших страдают цереброгенными астено-вегетативными расстройствами, неврологическими и психическими дефицитами различной степени тяжести.

Пневмококковые менингиты, как правило, являются следствием вторичной локализации S.pneumoniae, и осложняют течение пневмонии, отита, синусита и других гнойно-септических заболеваний. В тех случаях, когда определить первичную локализацию пневмококковой инфекции не удается, говорят о первичном пневмококковом менингите. Инфицирование оболочек и вещества головного мозга чаще всего происходит гематогенным путем, но возможно распространение возбудителя в результате непосредственного перехода из гнойных очагов расположенных вблизи оболочек мозга (гнойный отит или гайморит), либо путем метастазирования из более отдаленных очагов (абсцесс легкого), либо в результате травмы. Фоном для развития пневмококкового менингита служат острые респираторные заболевания, грипп и другие простудные заболевания.

По капсульным полисахаридам пневмококки разделены на 90 серотипов, имеющих различное эпидемиологическое значение. Из наиболее опасных серотипов приготовлены пневмококковые вакцины, использующиеся для вакцинации групп риска. В группы риска в первую очередь входят дети в возрасте до года и лица пожилого возраста старше 65 лет, лица, имеющие в анамнезе хронические заболевания сердца, легких, печени (особенно у больных алкоголизмом), почек, эндокринную патологию, сахарный диабет, гематологические, онкологические заболевания, черепно-мозговые травмы, ликворею, иммунодефициты различного генеза.

4. Основные принципы лабораторной диагностики
менингококковой инфекции и гнойных
бактериальных менингитов

Основные принципы лабораторной службы по этиологической расшифровке гнойных бактериальных менингитов и подтверждению клинического диагноза базируются на особенностях самого заболевания:

— тяжелейший симптомокомплекс клинических проявлений в первые дни болезни указывает на необходимость экстренного незамедлительного проведения исследований по определению этиологии заболевания с обязательным использованием методов экспресс-диагностики;

— ответ должен быть не только быстрым, но и безошибочно точным. Это чрезвычайно актуально для ГБМ, так как заболевания полиэтиологичны по своей природе. Данное обстоятельство необходимо учитывать при организации работы лабораторий по этиологической расшифровке заболеваний. Показано, что практически любой микроорганизм может быть причиной бактериального менингита, но основных возбудителей три. Это менингококки, пневмококки и гемофильные палочки типа «b», отвечающие за 85-90% от общего числа расшифрованных случаев. На выявление этих основных возбудителей и должны быть направлены все силы и средства лабораторий, занимающихся исследованием материала от больных с подозрением на бактериальный менингит;

— учитывая то, что очагом воспаления являются мягкие мозговые оболочки головного мозга и спинной мозг, основным материалом для исследования является спинномозговая жидкость (СМЖ). Кроме того, из-за возникающей генерализации процесса обязательным объектом исследования является и кровь.

Теоретическое обоснование подходов к лабораторной диагностике бактериальных менингитов (в том числе и генерализованных форм менингококковой инфекции) следует сочетать с адекватной практической составляющей. Основой рутинного алгоритма ежедневной работы являются специальные требования к объему патологического материала подлежащего исследованию и комплексное методологическое оснащение исследований.

5. Отбор материала для исследования

Основным биологическим материалом для исследования при бактериальных менингитах служит спинномозговая жидкость и кровь. Для бактериологического подтверждения менингококкового назофарингита и выявления назофарингеального менингококкового носительства исследуют носоглоточную слизь.

5.1. Спинномозговая жидкость.

Спинномозговую жидкость отбирают у больного при пункции в объеме 2,0-5,0 мл на этапе поступлении в стационар до начала антибиотикотерапии с соблюдением правил асептики. Ликвор после пункции распределяют для исследования следующим образом:

— 1,0 мл направляют в клиническую лабораторию для проведения общего ликворологического и цитологического исследования;

— 0,2 мл направляют для постановки полимеразной цепной реакции, которую выполняют в лабораториях, специально оснащенных всем необходимым для проведения такого рода исследований и имеющих разрешение на данный вид деятельности в установленном порядке;

— 1,0 мл направляют для первичного бактериологического посева (если не сделан в отделении при пункции), бактериоскопии и серологических исследований;

— 0,5 мл засевают в чашку с «шоколадным» агаром непосредственно у постели больного. Далее чашку хранят в условиях термостата при 37 град. C до доставки в лабораторию. Применение данной методики позволяет получить культуру возбудителя бактериального менингита на 18-24 часа раньше, чем по стандартной схеме посева материала в лаборатории и, тем самым, ускорить проведение исследования и выдачу ответа;

— 0,5 мл ликвора засевают в среду обогащения (в 5,0 мл 0,1% полужидкого питательного агара) непосредственно у постели больного и далее хранят при 37 град. C в условиях термостата до доставки в лабораторию.

Кровь отбирают из вены при поступлении больного в стационар с соблюдением правил асептики и до начала антибиотикотерапии. Образцы распределяют следующим образом:

— несколько капель крови наносят на предметное стекло для приготовления препарата «толстой капли» крови.

5.3. Назофарингеальная слизь.

Назофарингеальную слизь с задней стенки глотки берут натощак или через 3-4 часа после еды стерильным ватным тампоном. Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка для наиболее полного открытия глоточного отверстия. Тампон вводят ватным концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2-3 раза по задней стенке. При извлечении из носоглотки тампон не должен касаться окружающих тканей (зубы, слизистая щек, язык, небный язычек). После извлечения из носоглотки содержащуюся на тампоне слизь засевают на чашки (сывороточный агар и сывороточный агар с линкомицином) или помещают в транспортировочную среду для немедленной доставки в лабораторию. Допускается применение готовых питательных транспортировочных сред, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

6. Доставка и хранение материала

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляют в бактериологическую лабораторию немедленно после отбора в специальных контейнерах, способных поддерживать температуру 37 град. C. При невозможности быстрой доставки материала из отделения в лабораторию (ночное время, выходные и праздничные дни и др.) материал хранят следующим образом:

— посевы ликвора на первичной чашке с «шоколадным» агаром и в 0,1% полужидком питательном агаре, а так же посев крови на гемокультуру хранят в условиях термостата при 37 град. C;

— нативный ликвор и кровь для серологических исследований хранят в условиях холодильника при +4 град. C. В лаборатории нативный ликвор используют только для бактериоскопии и постановки серологических реакций (латекс-агглютинация, ВИЭФ и др.). Для бактериологического посева хранившийся в холодильнике нативный ликвор не используют.

7. Методы исследования

7.1.1. Мазок нативного ликвора.

На предметное стекло наносят каплю ликвора из осажденного после центрифугирования слоя и высушивают при комнатной температуре или в условиях термостата при 37 град. C. Далее на препарат наносят краситель (водно-спиртовой раствор метиленовой сини) и после 2-х минутной экспозиции проводят тщательное, но осторожное промывание водопроводной водой. Препарат подсушивают и микроскопируют под иммерсией при большом увеличении, просматривая не менее 20 полей зрения или до обнаружения морфологически четких микробных клеток.

7.1.2. Культуральный мазок по Граму в модификации Калины.

7.1.3. Мазок препарата «толстая капля» крови.

На середину предметного стекла наносят каплю крови и распределяют с помощью чистого стерильного аппликатора так, чтобы диаметр мазка соответствовал величине пятикопеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Данный фрагмент исследования выполняют непосредственно у постели больного при его поступлении в стационар. Далее препарат доставляют в бактериологическую лабораторию. Окраску мазка производят водно-спиртовым раствором метиленовой сини в течение 2-3 минут, без предварительной фиксации. После окрашивания препарат осторожно промывают водой и подсушивают на воздухе. Препарат смотрят под иммерсией при большом увеличении, просматривая не менее 20 полей зрения или до обнаружения морфологически четких микробных клеток.

7.2. Бактериологический посев.

7.2.1. Бактериологический посев спинномозговой жидкости.

Культивацию посевов и дальнейший ход исследований проводят так же как описано выше.

7.2.2. Бактериологический посев крови.

Посев крови выполняют во флаконы с «двухфазной» питательной средой в соотношении крови к жидкой фазе 1:10 для уменьшения бактерицидного эффекта человеческой сыворотки. «Двухфазная» питательная среда содержит X, V факторы роста и витамины. На ней хорошо растут менингококки, пневмококки, гемофильные палочки и другие менее требовательные к составу питательной среды микроорганизмы.

Представляется перспективным использование готовых «двухфазных» сред для посева крови, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке. Эти среды сбалансированы по питательным свойствам, обогащены различными ростовыми добавками, содержат вещества, инактивирующие действие сыворотки крови и антибиотиков, имеют оптимальный газовый состав.

Засеянную в отделении кровь доставляют в лабораторию и инкубируют в течение 5 суток при температуре 37 град. C. Посевы ежедневно просматривают на наличие микробного роста. Признаками микробного роста на «двухфазной» среде служит помутнение жидкой среды, наличие хлопьевидного осадка, газообразование, образование пленки. Часто изменения «жидкой» фазы среды сопровождаются ростом колоний на «плотной» фазе среды.

В связи с тем, что рост некоторых микробов не приводит к визуально заметным изменениям прозрачности и цвета жидкой фазы питательной среды рекомендуется выполнить посев на «шоколадный» агар через 48 часов инкубации, даже, несмотря на отсутствие признаков микробного роста во флаконе. При отрицательном результате посева следует продолжить инкубирование флакона.

В случае обнаружения роста микроорганизмов в «двухфазной» питательной среде, флакон вскрывают и из бульона или выросших на твердой фазе колоний готовят мазок, окрашенный по Граму. По результатам микроскопии выполняют высев на чашки с «шоколадным» агаром для выделения менингококков, пневмококков и гемофильных палочек типа «b». В других случаях, в соответствии с данными бактериоскопического исследования к указанному набору сред добавляют любые адекватные питательные среды (желточно-солевой агар, среда Эндо, среда Сабуро и др.) для выделения и идентификации «прочих» возбудителей ГБМ.

После получения роста микроорганизмов на плотных средах из выросших колоний готовят мазок по Граму, определяют оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую биохимическую, серологическую идентификацию, определяют чувствительность к антибиотикам.

7.2.3. Бактериологический посев носоглоточной слизи.

Посев выполняют немедленно после забора материала или после доставки материала в лабораторию на чашки с сывороточным агаром и на чашки с селективным сывороточным агаром (в качестве селективной добавки используют линкомицин). Материал засевают путем втирания тампона на четверть чашки. Оставшуюся часть агара на чашке засевают штриховым методом с помощью стерильной бактериологической петли. Засеянные чашки инкубируют в условиях термостата при 37 град. C в течение 24-х часов. При обнаружении колоний, визуально сходных с ростом менингококков, выполняют отсев на чашки с сывороточным агаром. После культивирования посевов в условиях термостата при 37 град. C из выросших колоний готовят мазок по Граму в модификации Калины, определяют оксидазу, каталазу и проводят дальнейшую идентификацию.

7.3. Реакция латекс-агглютинации (экспресс-метод).

Наиболее простым методом, не требующим сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, является метод латекс-агглютинации, позволяющий в течение 15 минут дать заключение об отсутствии или наличии в СМЖ больного специфических антигенов. Реакцию проводят при наличии признаков гнойного воспаления в ликворе и/или при бактериоскопическом обнаружении в нем возбудителей. Предварительно СМЖ необходимо прогреть в течение 5 минут при 100 град. C и отцентрифугировать при 1500-2000 об/мин. Для проведения реакции используют прозрачную надосадочную жидкость. Одну каплю каждого латексного реактива (предварительно реактивы рекомендуется тщательно встряхнуть) наносят на специальные бумажные карты, приложенные к набору. Затем добавляют 30 мкл СМЖ (надосадочная фракция) к каждой капле латексного реактива. Перемешивают чистым аппликатором. Осторожно покачивают бумажную карту. Агглютинация в течение 2-х минут с одним из латекс-диагностических препаратов свидетельствует о присутствии в испытуемом образце специфического антигена. Для выполнения реакции используют наборы латекс-диагностических препаратов, разрешенные к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

Реакция позволяет с помощью специфических антисывороток выявлять полисахаридный антиген возбудителя в СМЖ и сыворотке крови больного уже в первый день исследования материала. Для проведения реакции необходимы: проба СМЖ (осадок, если ликвор мутный) и/или сыворотка крови, преципитирующие антисыворотки, веронал-мединаловый буфер, 1% агар на веронал-мединаловом буфере, любой аппарат для иммуноэлектрофореза, стеклянные пластины размером 9×12 см, трафареты, пробойники для агара, отсасывающие агар устройства, пастеровские пипетки или дозаторы с наконечниками, фильтровальная бумага, предметный столик или другой объект с идеально ровной поверхностью.

В аппарат для иммуноэлектрофореза заливают веронал-мединаловый буфер, содержащий в 1 литре дистиллированной воды 21,9 грамм мединала и 3,35 грамм веронала (веронал предварительно нагревают на водяной бане в небольшом количестве дистиллированной воды до полного растворения). Измеряют рН и доводят его до уровня 8,6. Далее на веронал-мединаловом буфере (предварительно развести дистиллированной водой в 4 раза) готовят 1% агар. На 100 мл буфера добавляют 1 грамм агара, нагревают на водяной бане до полного растворения и в горячем, но несколько охлажденном виде (температура 60-70 град. C) в количестве 20 мл наносят на стеклянные пластины размером 9×12 см. Пластину предварительно помещают на ровную горизонтальную поверхность. После застывания агара специальным пробойником или металлической трубкой с диаметром 3 мм высекают два параллельных ряда отверстий по длине стекла на расстоянии 3 мм друг от друга.

7.5. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Исследование сыворотки больного в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации является вспомогательным методом диагностики менингококковой инфекции и позволяет существенно увеличить процент лабораторного подтверждения генерализованных форм менингококковой инфекции. Для получения достоверного результата обязательным условием является исследование сывороток крови больного в динамике, т.е. взятых в разные сроки заболевания (на 1-й и 10-12-й дни болезни).

В соответствии с приказом Минздрава России N 375 от 23 декабря 1998 года «О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов» РНГА можно выполнять как макро- так микрометодом с соблюдением соотношения ингредиентов.

Одной из модификаций микрометода является постановка РНГА в полистироловых пластинах с объемом лунок не менее 300 мкл с использованием автоматических дозаторов на 50 мкл и 100 мкл.

Необходимые реагенты: диагностикумы эритроцитарные менингококковые полисахаридные серогрупп A и C; исследуемая сыворотка, разведенная 1:5; забуференный физиологический раствор (ЗФР).

7.6. Методы определения лекарственной чувствительности.

Методы определения чувствительности микроорганизмов подразделяют на методы серийных разведений и диффузные методы. Методы серийных разведений в бульоне и агаре основаны на прямом воздействии антибактериального препарата (АБП) и количественном определении минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика по отношению к исследуемому микроорганизму. Их чаще используют при проведении научно-исследовательских работ.

Диффузионные методы основаны на подавлении роста исследуемой культуры при диффузии из носителя антибактериального препарата в плотную питательную среду. Существуют две модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест.

8. Лабораторная диагностика менингококковой
инфекции и гнойных бактериальных менингитов

Специфические клинические проявления генерализованных форм менингококковой инфекции и гнойного бактериального менингита являются обоснованием для проведения соответствующего обследования больного при поступлении его в стационар. Приоритетным при этих заболеваниях является комплексное исследование СМЖ и крови. Общая схема проведения исследования ликвора представлена на рисунке 1 (не приводится). Общая схема проведения исследования крови представлена на рисунке 2 (не приводится).

8.1. Менингококковая инфекция.

8.1.1. Характеристика возбудителя.

Возбудителем менингококковой инфекции является менингококк (Neisseria meningitidis), который относят к роду нейссерий, включенному (согласно «Определителя бактерий Берджи») в состав 4-й группы микроорганизмов, озаглавленной как » Грамотрицательные, аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки». Морфологически клетки менингококков имеют округлую форму и размеры порядка 0,6-1,0 мкм. Величина микробных клеток и их форма могут различаться, что определяет характерный для менингококков признак клеточного «полиморфизма». Этот признак особенно выражен в мазках из свежих культур, при этом общая морфологическая картина культурального мазка, окрашенного по Граму, имеет вид лежащих беспорядочно полиморфных (по величине и окраске) грамотрицательных кокков (эффект «рассыпанного гороха»). Парное расположение менингококков (диплококков) наблюдают в препаратах, приготовленных из жидкостей и органов пораженного организма. В спинномозговой жидкости менингококки часто располагаются внутрилейкоцитарно и имеют форму кофейного зерна.

Определение серогрупповой характеристики менингококков является важнейшей составляющей в системе эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией. Существующие современные классификации менингококков по различным антигенным системам (белки, липополисахариды, пили и другие) позволяют определять их популяционные особенности и отбирать наиболее иммуногенные компоненты для конструирования вакцинных препаратов нового поколения.

8.1.2. Лабораторная диагностика генерализованных форм менингококковой инфекции.

Диагностику генерализованных форм менингококковой инфекции проводят в соответствии с общей схемой исследования материала при гнойных бактериальных менингитах. Лабораторное подтверждение ГФМИ и выявление менингококков выполняют по следующим тестам:

— обнаружение в нативном материале диплококков с характерными морфологическими признаками;

— характерный рост только на высокопитательных средах;

— типичная морфология культурального мазка по Граму;

— сахаролитическая активность в отношении глюкозы и мальтозы;

— выявление группоспецифических свойств;

— обнаружение специфических антигенов в ликворе и/или сыворотке крови в реакциях латекс-агглютинации и ВИЭФ (экспресс-методы);

— детекция специфических антител в сыворотке крови в реакции РНГА.

При бактериоскопии нативного ликвора или препарата крови «толстая капля» (окраска водно-спиртовым раствором метиленовой сини) на голубом фоне обнаруживают морфологически четкие окрашенные в темно-синий цвет кокки, диплококки, напоминающие кофейные зерна или семена бобов, прилегающие друг к другу вогнутыми сторонами, иногда выявляют капсулу. Микробные клетки могут располагаться как вне- так и внутрилейкоцитарно. Интенсивность обсеменения СМЖ микробными клетками колеблется в значительных пределах и зависит от стадии развития инфекционного процесса в момент взятия материала. Если осуществлялось лечение антибиотиками, типичная морфология микробных клеток теряется.

При посеве на питательные среды и дальнейшей инкубацией в течение 24 часов при 37 град. C в атмосфере с 5-10% CO2 и повышенной влажностью проявляются следующие тинкториальные свойства:

— на полужидкой питательной среде (0,1% полужидкий сывороточный агар) менингококки вызывают интенсивное помутнение в верхней части столбика среды;

— на «двухфазной» питательной среде при посеве крови отмечают помутнение жидкой фазы и рост полупрозрачных сероватых колоний на границе плотной и жидкой фаз;

— на чашках с «шоколадным» агаром менингококки растут в виде нежных полупрозрачных сероватых колоний с идеально ровными краями, с блестящей поверхностью, размером 1-2 мм. Имеют маслянистую консистенцию, не меняют цвета среды, не имеют запаха. С увеличением времени культивирования тинкториальные свойства меняются;

— на чашках с сывороточным агаром менингококки растут в виде полупрозрачных, нежных голубоватых колоний с ровными краями и гладкой блестящей поверхностью;

— на чашках без добавления нативных сыворотки и крови животного происхождения, так же на чашках с добавлением желчи менингококки не растут.

При определении сахаролитической активности проводят учет результатов посева чистой культуры на плотные питательные среды с углеводами. Метод дает возможность дифференцировать различные виды нейссерий и некоторые другие виды микроорганизмов (таблица 3).

Сахаролитическая активность
Neisseria и Moraxella

Менингококки ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты. Иногда наблюдают вариабельность сахаролитической активности у различных штаммов одного и того же вида. Для уточнения биохимических свойств менингококков используют тест-системы, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. Тест-системы позволяют провести расширенное изучение ферментативной и метаболической активности менингококков (по 13 параметрам и более) и в течение 2-х часов определить видовую принадлежность возбудителя.

Определение серогруппы у менингококков проводят в реакции агглютинации на стекле с набором агглютинирующих серогрупповых антисывороток (серогруппы A, B, C, X, Y, Z, W-135, 29E), разрешенных к применению для этих целей в установленном порядке в Российской Федерации. Реакцию проводят только с чистой культурой менингококков, с успехом прошедшей все этапы идентификации. Менингококки серогрупп A, B и C наиболее часто являются причиной возникновения генерализованных форм менингококковой инфекции. Поэтому в первую очередь с антисыворотками к менингококкам этих серогрупп выполняют реакцию агглютинации. На предметное стекло, разделенное маркером на три части, наносят физиологический раствор (по капле на каждую часть). Далее стерильной петлей, деревянной палочкой или любым другим аппликатором с поверхности агаровой среды снимают культуру менингококков и тщательно растворяют в каплях физиологического раствора на стекле. После этого, если не выявлено спонтанной агглютинации с физиологическим раствором, в три подготовленные части добавляют антисыворотки A, B и C (по капле) и перемешивают. Учет реакции проводят через 1-2 минуты. Образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля указывает на положительную реакцию специфического взаимодействия антигена и антитела и позволяет определить серогруппу менингококков. Отсутствие реакции с одной из основных серогрупповых антисывороток, указывает на необходимость продолжения проведения аналогичных исследований с другими специфическими антисыворотками (X, Y, Z, W-135, 29Е). Только в том случае, если подтвержденный всеми тестами штамм менингококка не показал положительного результата в реакции агглютинации с полным набором агглютинирующих антисывороток, его следует отнести к категории неаггютинирующегося штамма (НА).

Экспресс-методы. Реакцию латекс-агглютинации с нативным ликвором (экспресс-метод) проводят при наличии в нем признаков гнойного воспаления и/или при бактериоскопическом обнаружении возбудителей. Использование реакции позволяет в кратчайшие сроки (15-20 минут) выявить специфические антигены менингококков самых распространенных серогрупп (A, B, C, Y, W-135). Реакцию выполняют с помощью наборов, разрешенных к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке, согласно инструкции по применению. Реакция встречного иммуноэлектрофореза (экспресс-метод) позволяет с помощью специфических антисывороток (преципитирующих) к различным серогруппам менингококков в течение 30 минут выявлять полисахаридный антиген возбудителя в СМЖ и сыворотках крови, взятых у больных в первый день поступления в стационар.

Реакция непрямой гемагглютинации с «парными» сыворотками крови выявляет динамику нарастания титров специфических антител к менингококку и позволяет определить принадлежность возбудителя к наиболее распространенным серогруппам менингококков (A и C). Использование метода дает возможность провести ретроспективную лабораторную диагностику генерализованных форм менингококковой инфекции, так как окончательный ответ получают только через 12-14 дней после начала заболевания. Преимущественными возможностями метода является лабораторное подтверждение менингококкцемии, при которой использование других методов лабораторной диагностики, как правило, мало эффективны. Характеристика эритроцитарных менингококковых диагностикумов, условия их хранения и техника постановки реакции непрямой (пассивной) гемагпотинации изложены в инструкциях по применению препаратов.

8.1.3. Лабораторная диагностика менингококковых назофарингитов и бактерионосительства.

Подробная схема проведения исследования представлена на рисунке 3 (не приводится). Окончательным этапом является серогруппирование менингококков и определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

8.1.4. Чувствительность менингококков к антибактериальным препаратам.

Менингококки остаются высокочувствительными к пенициллину, который является основным лекарственным препаратом при лечении больных генерализованными формами менингококковой инфекции. Несмотря на то, что в зарубежной печати появляются сообщения об обнаружении менингококков со сниженной чувствительностью к пенициллину, длительные динамические наблюдения за российскими штаммами менингококков не выявили резистентных и умеренно резистентных штаммов. Современная тактика проведения исследований по определению чувствительности менингококков к антибактериальным препаратам предусматривает применение только тех методов, которые позволяют определять минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибактериального препарата, при этом рекомендуется использовать методы серийных разведений в агаре или в бульоне и метод Е-тестов. Диско-диффузионный метод не используется для достоверного определения чувствительности менингококков к антибактериальным препаратам из-за трудностей по интерпретации результатов. Наиболее широкое распространение в современных условиях получил количественный метод Е-тестов.

Для выполнения процедуры требуются: чашки с питательной средой Мюллер-Хинтон с 5% крови барана, бактериальная суспензия менингококков мутностью 0,5 по стандарту МакФарланд, стрипы Е-тестов бензилпенициллина, цефотаксима, цефтриаксона, хлорамфеникола, доксициклина, рифампицина и триметоприма. Бактериальную суспензию менингококков мутностью 0,5 по стандарту МакФарланд засевают на чашки с использованием ватного тампона. Тампон смачивают в суспензии, несколько отжимают о стенки пробирки и далее проводят посев путем тщательного втирания содержащейся в тампоне бактериальной массы в поверхность питательной среды. Е-тесты осторожно накладывают на поверхность чашки. Количество стрип на одной чашке определяют ее диаметром. На обычной чашке диаметром 90 мм можно наложить только 2 стрипа, поэтому целесообразнее пользоваться чашками Петри большего диаметра (150 мм), применение которых позволяет наложить 5 стрипов. Чашки инкубируют при 37 град. C с 5% CO2 в течение 24-х часов и затем проводят учет результатов. Учитывая то, что стрипы Е-тестов содержат на своей поверхности различные концентрации антибактериального препарата, возможно определение той минимальной подавляющей концентрации (мкг/мл), которая еще лизирует бактериальную субстанцию. Оценку результатов проводят по таблице 4.

Критерии интерпретации результатов определения
чувствительности менингококков к антибактериальным
препаратам методом Е-тестов (мкг/мл)

8.2. Пневмококковые менингиты.

8.2.1. Характеристика возбудителя.

Возбудителем пневмококковых менингитов является Streptococcus pneumoniae или пневмококк, который (согласно «Определителя бактерий Берджи») входит в состав рода Streptococcus (группа стрептококков ротовой полости), включенных в 17-ю группу «Грамположительные кокки».

Это овальные, иногда вытянутые вдоль оси ланцетовидные кокки, диаметром 0,5-1,0 мкм, располагаются парами и окружены общей капсулой.

Строение клеточной стенки пневмококков типично для грамположительных бактерий. Ее основой является пептидогликан со встроенными углеводами, тейхоевыми кислотами, липопротеинами и поверхностными белками. Пневмококки неподвижны, спор не образуют, являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы. Для культивирования пневмококки нуждаются в богатых питательных средах, предпочитают капнофильные условия (5-10% CO2). Температурный оптимум 37 град. C. Каталазоотрицательны.

Капсулы пневмококков являются основным фактором вирулентности, защищающим микроб от опсонизации и последующего фагоцитоза. Некапсулированные штаммы авирулентны. Среди других факторов патогенности наибольшее значение имеет уровень активности гиалуронидазы, пневмолизина, гемолизина и др.

На выявлении специфического набухания капсулы возбудителя основана экспресс-диагностика пневмококков в патологическом материале с использованием поливалентной иммунной сыворотки (реакция Нейфельда). После нанесения поливалентной сыворотки на исследуемый материал, при микроскопии отмечают значительное увеличение капсулы пневмококков по сравнению с контролем.

По капсульному антигену также проводят типоспецифическую дифференцировку пневмококков, которых насчитывают не менее 90 серотипов. Серотиповой пейзаж возбудителя зависит от географической области, климатических условий, возраста больных, вида патологии и со временем может меняться. Выявление особенностей циркуляции пневмококков позволяет значительно снизить заболеваемость пневмококковой инфекцией за счет вакцинопрофилактики групп риска.

8.2.2. Лабораторная диагностика.

Диагностику пневмококковых менингитов проводят согласно общей схемы исследования материала при бактериальных менингитах. Идентификацию пневмококков выполняют по следующим тестам:

— обнаружение в нативном материале (ликвор и/или кровь) диплококков, окруженных капсулой;

— рост на средах, содержащих кровь с образованием альфа-гемолиза;

— характерная морфология культурального мазка по Граму;

— положительная проба с оптохином;

— чувствительность к желчным кислотам;

— выявление специфического антигена в реакции латекс-агглютинации (экспресс-метод).

При бактериоскопии нативного ликвора или препарата крови «толстая капля» (окраска водно-спиртовым раствором метиленовой сини) обнаруживают овальные или ланцетовидные диплококки, окруженные капсулой, которые могут образовывать короткие цепочки. Капсула хорошо заметна на окрашенном фоне, выделяясь более светлым цветом. У больных, получавших антибиотики, типичная морфология пневмококка теряется, капсула истончается и малозаметна. В начальной стадии пневмококкового менингита в ликворе можно наблюдать значительное количество микробных клеток при небольшом количестве клеточных элементов воспаления (сегментоядерные лейкоциты).

При посеве на питательные среды и дальнейшей инкубации в течение 24 часов при 37 град. C в атмосфере 5-10% CO2 с повышенной влажностью выявляют следующие тинкториальные свойства:

— на жидких и полужидких питательных средах (0,1% сывороточный агар) пневмококки растут в верхней части столбика среды, с постепенным диффузным помутнением всего объема. При длительной инкубации выпадает хлопьевидный осадок;

— на «двухфазной» питательной среде отмечают помутнение жидкой среды и рост мелких прозрачных колоний на границе «жидкой» и «плотной» фазы;

Биохимическая активность пневмококков во многом совпадает с активностью других зеленящих стрептококков. Для дифференциальной диагностики следует использовать пробу с оптохином и тесты на чувствительность к желчным кислотам.

Чувствительность к желчным кислотам (пневмококки лизируются в присутствии желчных кислот) можно определить с помощью желчного теста или дезоксихолатной пробы:

— желчный тест: на выросшую культуру S.pneumoniae накладывают бумажный диск, содержащий 20% раствор желчи крупного рогатого скота. Чашку инкубируют в термостате 1-2 часа при температуре 37 град. C. Вокруг диска с желчью появляется зона лизиса (1-2 мм) колоний пневмококков. Другие стрептококки к воздействию желчи устойчивы. Диски не стандартизированы по содержанию желчных кислот, поэтому к результатам теста следует относиться с настороженностью;

Пневмококки каталазоотрицательны. Разлагают до кислоты глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментируют маннит, салицин, сорбит. Ферментируют инулин.

Для биохимической идентификации пневмококков используют тест-системы, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке.

Реакцию латекс-агглютинации с нативным ликвором (экспресс-метод) для выявления специфических антигенов пневмококков выполняют в случае обнаружения в нем диплококков при бактериоскопическом исследовании, или гнойного ликвора с помощью диагностических наборов, разрешенных к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. Получение четкой положительной реакции с латексным диагностическим препаратом на пневмококки позволяет в течение 15-20 минут определить этиологию возбудителя.

8.2.3. Чувствительность пневмококков к антибактериальным препаратам.

Изучение чувствительности к антибиотикам проводят методом серийных разведений в бульоне или в агаре и диско-диффузионным методом. Для метода серийных разведений в бульоне рекомендуется использовать бульон Мюллер-Хинтон с добавлением лизированной лошадиной крови. Для метода серийных разведений в агаре и диско-диффузионного метода используют агар Мюллер-Хинтон с добавлением 5% дефибринированной крови барана.

Учитывая, что агар Мюллер-Хинтон доступен не для всех практических лабораторий, возможно использование вместо среды АГВ (агар Гивенталя-Ведьминой) с добавлением 5% дефибринированной крови барана. На среде АГВ можно определять чувствительность пневмококков к оксациллину, кларитромицину, азитромицину, клиндомицину, офлоксацину, диаметры зон подавления роста которых не отличаются от результатов полученных на агаре Мюллер-Хинтон. Однако среду АГВ не используют для определения чувствительности пневмококков к ко-тримоксазолу из-за повышенного содержания тимина и тимидина, снижающих антимикробную активность препарата in vitro.

Наиболее важным является определение чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, карбапенемам, цефалоспоринам), хлорамфениколу, рифампицину, которые являются препаратами выбора для лечения пневмококковых менингитов. Дополнительно изучают чувствительность к макролидам, линкозамидам, ко-тримоксазолу. Включение в исследование эритромицина и клиндамицина позволяет выявить полную или частичную перекрестную устойчивость пневмококков к макролидам, линкозамидам и стрептограминам. Устойчивость к ко-тримоксазолу часто сопровождается резистентностью к пенициллину. Критерии оценки чувствительности штаммов S.pneumoniae к антибактериальным препаратам отражены в таблице 5.

Критерии оценки чувствительности пневмококков
Пограничные значения диаметров зон задержки роста
и величин МПК антибиотиков

Потребность в X и V факторах роста определяют путем посева чистой культуры на сывороточный агар, не содержащий факторы роста. Далее на поверхность засеянной чашки накладывают диски, пропитанные X и V факторами роста. Расстояние между дисками 5 мм. Колонии Haemophilus influenzae растут только между дисками.

Реакцию латекс-агглютинации с нативным ликвором (экспресс-метод) проводят при наличии признаков гнойного воспаления и/или при обнаружении бактериальных клеток. Применяют наборы латекс-диагностикумов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке, которые позволяют выявлять специфические антигены гемофильных палочек типа «b» в ликворе и /или крови. С помощью латекс-диагностического препарата проводят определение типовой принадлежности у выделенной из ликвора и крови культуры Haemophilus influenzae. Четкая реакция латекс-агглютинации Hib-латекс-диагностикума и тестируемой культуры Haemophilus influenzae, предварительно прошедшей этапы идентификации, позволяет отнести ее к Haemophilus influenzae типа «b».

8.3.3. Чувствительность Haemophilus influenzae к антибактериальным препаратам.

Результаты определения лекарственной чувствительности используют для выбора наиболее эффективного антибактериального препарата для лечения больных и для сбора эпидемиологической информации об устойчивости к антибактериальным средствам микроорганизмов, циркулирующих в определенных регионах и представляющих угрозу для общественного здравоохранения. Контроль за лекарственной чувствительностью Haemophilus influenzae приобретает особую актуальность из-за возрастания потенциала резистентных к антибактериальным препаратам штаммов. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз. Данное обстоятельство указывает на ограничения при использовании бета-лактамных антибиотиков при лечении гнойно-септических инфекций, вызванных Haemophilus influenzae и необходимость выбора наиболее эффективных препаратов на основании данных антибиотикограммы. Для изучения чувствительности используют диско-диффузионный метод и диффузионный количественный метод Е-тест.

Особые требования предъявляют к выбору питательной среды и наиболее приемлемым вариантом признана питательная среда HTM (Haemophilus Test Medium), содержащая в своем составе необходимые для гемофил факторы роста и позволяющая достоверно интерпретировать результаты.

Среду НТМ можно приготовить в лаборатории на основе бульона или агара Мюллер-Хинтон. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до конечной концентрации 5 мг/мл) и раствор гематина (до конечной концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01 N NaOH (0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения. В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30,0 мл основного раствора гематина. После автоклавирования и охлаждения основы до 48-50 град. C в нее асептически вносят раствор никотинамидадениндинуклеотид (НАД) до конечной концентрации 15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм. Следует помнить, что при определении чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму в охлажденную до 48-50 град. C среду асептически вносят также раствор тимидин фосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ед./мл.

Выполнение диско-диффузионного метода предусматривает посев чистой, свежей культуры на чашки со средой НТМ. Предварительно готовят микробную суспензию мутностью 0,5 по стандарту МакФарланд. Ватный стерильный тампон смачивают в суспензии, несколько отжимают о стенки пробирки и выполняют посев на поверхность среды путем тщательного втирания бактериальной суспензии. Далее накладывают на поверхность среды диски обычным способом, не более 5 дисков на чашку диаметром 90 мм. Чашки инкубируют при 37 град. C на протяжении 24 часов в атмосфере с 5-10% CO2. Затем проводят учет результатов путем замера зон задержки роста и сопоставления полученных данных с оценочной таблицей. Метод позволяет классифицировать исследованные штаммы на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные. Рекомендуемый перечень антибактериальных препаратов для определения чувствительности Haemophilus influenzae приведен в таблице 8, а критерии интерпретации результатов определения чувствительности Haemophilus influenzae приведены в таблице 9.

Рекомендуемый перечень антибактериальных
препаратов для чувствительности
Haemophilus influenzae

Критерии интерпретации результатов определения
чувствительности Haemophilus influenzae:
пограничные значения диаметров зон
подавления роста (мм) и МПК (мг/л)
антибактериального препарата