Что применяют для фиксации операционного и биопсийного материала
Фиксация гистологического и биопсийного материала
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФИКСАЦИИ
Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур иихуплотнение, прекращает аутолиз, стабилизирует локализацию структур. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов. Для достижения этой цели возможны 3 подхода:
3. Химическая фиксация:
· Альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· спирты (этанол, метанол)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
Мы рассмотрим третий вариант. Прижизненно взятая ткань должна быть зафиксирована на протяжении (не больше)30-90 минут, температура фиксатора – 0-4С
Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Увеличение температуры фиксатора ускоряет процесс, но вызывает еще большие изменения в тканях. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку. Для каждого конкретного вида исследования подбирают наиболее приемлемый фиксатор.
1. После вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор.
2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10—20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора.
3. В том случае, если цвет фиксатора изменяется после погружения в него кусочков ткани, фиксатор необходимо немедленно сменить.
4. Недопустимо повторное использование фиксаторов.
5. Для каждого фиксатора следует соблюдать установленное время фиксации. Длительное пребывание материала возможно лишь в некоторых фиксаторах, например 10 % нейтральном формалине, жидкости Боуэна.
Для фиксации лучше использовать емкости с широким горлом, чтобы не возникло проблем с извлечением фиксированного материала. Равномерность фиксации некоторых рыхлых тканей, например легочной, достигается помещением их на дно банки, а поверх них — прокладки из слоя марли или ваты.
Чаще материал фиксируют при комнатной температуре, но для некоторых видов исследования (гистохимических, электронно-микроскопических и др.) необходимо проводить фиксацию при 4°С. Материал срочных биопсий фиксируют при повышенной температуре фиксатора.
В экспериментальных исследованиях применяют также прижизненный перфузионный метод фиксации и его сочетание с обычным погружением в фиксирующую жидкость.
ПРОСТЫЕ ФИКСИРУЮЩИЕ ЖИДКОСТИ
Химическая фиксация:
· альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· спирты (этанол, метанол)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
1. Альдегиды
Можно хранить месяцами, надо всего лишь контролировать рН.
Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Формальдегид – это газ, растворимый в воде до концентрации40% по массе, каким он и поступает в продажу под названием «Формалин». В гистологической практике используют 10% раствор формалина, что соответствует 4% формальдегиду.
.Из формальдегида готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12% формалин. Для этого в банку с 40% формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40% нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С
В водных незабуференных растворах Ф-д со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида. В результате точную Со Ф-да в растворах формалина установить не представляется возможным. Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70—80° С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электронно-микроскопических исследований.
Фиксатор может показывать себя не с лучшей стороны из-за примесей, в основном метанола(до16%).Для этого существуют методы приготовления свободного от метанола
4% ф-д по Гайеру
· 2гр параформальдегида + 50мл 0,1М фосфатного буфера(рН 7,4-7,6)=нагревают до 70с до просветления раствора, помешивают, охлаждают и фильтруют. Его рН 7,3-7,5.
40% ф-д по Глауерт
· готовят 40% параформальдегид(40гр порошка формальдегида + 100мл дистиллированной воды при нагревании до 65С, перемешивая.
+ несколько капель 40%гидроксида натрия до просветления раствора.
Солевой формол.
· Нейтральный 40% формалин 100 мл
· Хлорид натрия 8,5 г
· Водопроводная вода 900 мл
Продолжительность фиксации 48 ч при 20 ° С с последующей промывкой в проточной воде в течение 6—12 ч.
Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли ).
1. А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды.
2. Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия).
3. В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия).
Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов
1. Нитрат свинца 8гр
2. 40% раствор формальдегида 10мл
продолжительность фиксации 24 часа при комнатной Т( при 4С – 2-3дня, 10-14 дней при –25С).
Фиксатор Жандра для гликогена
1. Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей
2. Раствор формальдегида 40% 10 частей
3. Ледяная уксусная кислота 5 частей
Глутаровый альдегид для ферментов.
Обеспечивает наибольшую сохранность ферментов.
· 0,2М фосфатный или какодилатный буфер(рН 7,2-7,4) 50л
· 25%глутаровый альдегид 10мл
2.Тетраоксид осмия.
Приводит не коагулируются, а желатинизируются, ткани не сморщиваются. Одновременно является контрастирующим веществом в электронной микроскопии. Дорогой реагент, поступает в продажу в ампулах по 0,5 – 2 гр. Разбивают в бумаге и помещают в
воду больше 24ч для 1-4 % раствора. Хранят в темноте при комнатной температуре месяцами. Для первичной фиксации липидов используют 1% раствор на 0,1М фосфатном буфере. Для 1 фиксации
· натрия хлорид 850мг
· 0,2М фосфатный буфер 5мл
Для вторичной используют сахарозу вместо натрия.
Раствор Флеминга
· 1% раствор хромовой кислоты на дв 7,5мл
· ледяная уксусная кислота 0,5мл (смешивать перед использованием)
3.Хромовая кислота.
Для стабилизации липидов, для фиксации гликогена и нуклеиновых кислот.
Фиксатор Элфтмана (бихроматсулема)
· Бихромат калия 2,5 гр.
Продолжительность фиксации 3 дня.
4.Этиловый спирт (80 %, 90 %, 96 % и 100 %).
5.Уранилацетат
Ацетон (его действие подобно действию спирта). Ацетон используют для увеличения скорости фиксации. Применяют 100% ацетон, для получения которого в коммерческий ацетон засыпают прокаленный сульфат меди (медный купорос) или силикагель. В ацетоне фиксируют кусочки толщиной 3—4 мм в течение 2 ч при 20° С или 30 мин— 1 ч в термостате при 60 °С в плотно закрытой посуде. Ацетон значительно уплотняет ткань и при увеличении продолжительности фиксации возможно сморщивание объектов. Чаще ацетон применяют для обработки материала срочных биопсий при его заливке в парафин.
6.Кислоты.
Азотная, пикриновая, уксусная, трихлоруксусная. Быстро проникают, препятствуют сморщиванию,
ослабляют состояние гидратации. Входят в состав декальцинирующих смесей.
Фиксатор Жандра для гликогена
4. Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей
5. Раствор формальдегида 40% 10 частей
6. Ледяная уксусная кислота 5 частей
Жидкость Буэна
классический фиксатор для экспериментальных исследований.
· Насыщенный раствор пикриновой кислоты 75 мл
· Нейтральный 40 % формалин 25 мл
· Ледяная уксусная кислота 5 мл
Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20 °С. Насыщенный раствор пикриновой кислоты готовят заранее из расчета 3 г кристаллической пикриновой кислоты на 1 л горячей дистиллированной воды. После фиксации кусочки отмывают от избытка пикриновой кислоты в 70 % спирте, затем заливают в парафин.
Жидкость Карнуа
универсальный фиксатор для большинства гистологических и гистохимических исследований (кроме выявления липидов). Наилучший для кожи, для предупреждения пересушивания в качестве промежуточной среды используют хлороформ.
· Спирт 100 % или 96 % 60 мл
· Ледяная уксусная кислота 10 мл
Продолжительность фиксации 2—4 ч при 4 ° С или 1—2 при 20 °С. Затем материал помещают в 100 % спирт. Если материал не сразу подлежит проводке, то его можно перенести 96 % спирт и держать в нем до 3 суток.
Сюда также входят фиксирующие смеси по Боуену, Жандру, Карнуа, Лилли, Ценкеру, Бродскому, прочее.
7.Сулема (дихлорид ртути).
Сулему применяют в качестве фиксатора с начала развития гистологии. Готовят насыщенный раствор: 10 г сулемы на 100 мл дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 3 мм 6—12 ч при 20 °С. При фиксации сулемой возможно появление в тканях кристаллического осадка, который удаляют путем обработки срезов йодированным 70 % спиртом (на 50 мл 70 % спирта — 5—10 капель 5 % спиртового раствора йода до появления оранжевого цвета). По мере обесцвечивания йодированного спирта со срезами его заменяют свежей порцией вплоть до полной потери цвета, затем срезы промывают в 3—4 сменах 70 % спирта.
Составными частями сложных фиксаторов являются простые. Существует множество вариантов фиксирующих смесей. Ниже приведены наиболее распространенные.
Спирт-формол по Шаферу.
· 10 % нейтральный формалин, который готовят из 1 части нейтрального 40 % формалина и
· 2—3 частей 96 % спирта.
Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт.
Кальций-формол по Бейкеру (Проверено) используют для фиксации липидов.
· 10 мл 40% формалина + 90 мл дистиллированной воды.
· 1 г хлорида кальция.
Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.
Для гистохимических исследований с успехом применяют фиксатор Бейкера, приготовленный из параформальдегида.
· К 50 г параформальдегида и 500 мл дистиллированной воды добавляют с одновременным встряхиванием несколько капель 1 н. гидроксида натрия до исчезновения осадка.
· 10 г хлорида кальция + 500 мл дистиллированной воды.
Растворы А и Б смешивают, добавляют 0,5 г активированного угля. Перед использованием фильтруют.
Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.
Используется также фиксатор Карнуа, в состав которого входят
· 25 мл ледяной уксусной кислоты
Условия фиксации те же. В случае отсутствия этилового спирта вместо жидкости Карнуа можно использовать смесь следующего состава:
· Изопропиловый спирт 60мл
· Пропионовая кислота 30м
Продолжительность фиксации 12-24 ч при 20 °С; для промывки и обезвоживания применяют изопропиловый спирт.
Жидкость Ценкера — сулемовая смесь.
· Бихромат калия 2,5г
· Сульфат натрия 1 г
· Дистиллированная вод100мл(это-жидкость Мюллера).
· Ледяная уксусная кислота 5мл
Ледяную уксусную кислоту можно заменить нейтральным 10 % формалином (фиксатор Максимова, ценкер-формол). Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20°С. После фиксации материал в течение 12—24 ч отмывают в проточной воде и помещают в йодированный 70% спирт для удаления остатков сулемы. При добавлении 10 мл 2 % раствора тетраоксида осмия хорошо фиксируются и окрашиваются липиды.
В последнее время для гистологических исследований часто применяют глутаровый альдегид, параформальдегид, фиксаторы Ито, Замбони и др., особенно в тех случаях, когда материал предназначается одновременно для нескольких видов исследования (иммуноморфологического, электронно-микроскопического), а его количество ограничено, например, при пункционных биопсиях.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ
Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам (альдегиды, ацетоны, спирты), некоторые ядовиты (сулема, тетраоксид осмия, метанол), поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, которые используют в гистологической практике.
Фиксацию и вырезку материала необходимо производить в вытяжном шкафу. Материал, извлеченный из фиксатора, содержащего формалин, желательно в течение нескольких минут промыть в проточной воде, так как пары формалина оказывают раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и органов дыхания.
БЫСТРАЯ ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА СРОЧНЫХ БИОПСИЙ
Доставленный в лабораторию материал в случае необходимости вырезают или разрезают на несколько кусочков и фиксируют с помощью одного из способов быстрой фиксации. Если возможно, то следует часть материала сохранить для изготовления постоянных препаратов.
1. Материал помещают в металлический сосуд с ручкой и заливают теплым 10% нейтральным формалином, доводят до кипения, затем промывают проточной водой в течение 2—5 мин и режут на замораживающем микротоме или криостате.
2. Кусочки фиксируют в 100 % ацетоне в термостате при 56°С в течение 15 мин, затем помещают в хлороформ или ксилол для последующей заливки в парафин.
3. Материал фиксируют в смеси 10 % нейтрального формалина и 96 % спирта (1:1) в течение 15 мин при 56°С, затем промывают в 96 % спирте и обезвоживают в 100 % спирте.
4. М. Vinci и соавторы (1990) предложили метод фиксации кусочков ткани объемом 0,5—1 см 3 с применением микроволновой техники. Материал в растворе альдегида помещают на 20с в микроволновуюпечь (2,5 Гц/500 В), а затем оставляют на 10— 30 мин при комнатной температуре в том же фиксаторе. Микроволновое излучение способствует быстрому проникновению альдегидов в клетки и ткани, в результате чего улучшается качество фиксации. Этот способ позволяет проводить не только обычные гистологические, но и ультраструктурные цитохимические, иммуноморфологические исследования, а также рентгенологический микроанализ.
ВОЗМОЖНЫЕ АРТЕФАКТЫ, СВЯЗАННЫЕ С ФИКСАЦИЕЙ, И ИХ УСТРАНЕНИЕ
При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Пигмент удаляют, помещая срезы на 15—20 мин в 1—5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в 80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин.
В случаях значительного уплотнения ткани в результате слишком продолжительной фиксации кусочки помещают на 1—2 ч в 10% раствор лимонной кислоты, в результате чего материал становится более мягким и пригодным для исследования.
Кристаллический осадок, образующийся после фиксации с применением сулемы, удаляют из кусочков или лучше срезов с помощью йодированного 70 % спирта.
Фиксация гистологического и биопсийного материала
код для вставки на форум:
ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФИКСАЦИИ
Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур и их уплотнение, прекращает аутолиз, стабилизирует локализацию структур. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов. Для достижения этой цели возможны 3 подхода:
3. Химическая фиксация:
· Альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· спирты (этанол, метанол)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
Мы рассмотрим третий вариант. Прижизненно взятая ткань должна быть зафиксирована на протяжении (не больше)30-90 минут, температура фиксатора – 0-4С
Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Увеличение температуры фиксатора ускоряет процесс, но вызывает еще большие изменения в тканях. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку. Для каждого конкретного вида исследования подбирают наиболее приемлемый фиксатор.
Полноценная фиксация материала обеспечивается при соблюдении ряда требований.
1. После вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор.
2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10—20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора.
3. В том случае, если цвет фиксатора изменяется после погружения в него кусочков ткани, фиксатор необходимо немедленно сменить.
4. Недопустимо повторное использование фиксаторов.
5. Для каждого фиксатора следует соблюдать установленное время фиксации. Длительное пребывание материала возможно лишь в некоторых фиксаторах, например 10 % нейтральном формалине, жидкости Боуэна.
Для фиксации лучше использовать емкости с широким горлом, чтобы не возникло проблем с извлечением фиксированного материала. Равномерность фиксации некоторых рыхлых тканей, например легочной, достигается помещением их на дно банки, а поверх них — прокладки из слоя марли или ваты.
Чаще материал фиксируют при комнатной температуре, но для некоторых видов исследования (гистохимических, электронно-микроскопических и др.) необходимо проводить фиксацию при 4°С. Материал срочных биопсий фиксируют при повышенной температуре фиксатора.
В экспериментальных исследованиях применяют также прижизненный перфузионный метод фиксации и его сочетание с обычным погружением в фиксирующую жидкость.
ПРОСТЫЕ ФИКСИРУЮЩИЕ ЖИДКОСТИ
· альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид)
· спирты (этанол, метанол)
· кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная)
Можно хранить месяцами, надо всего лишь контролировать рН.
Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40% раствор формальдегида. Формальдегид – это газ, растворимый в воде до концентрации40% по массе, каким он и поступает в продажу под названием « Формалин». В гистологической практике используют 10% раствор формалина, что соответствует 4% формальдегиду.
.Из формальдегида готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12% формалин. Для этого в банку с 40% формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40% нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С
В водных незабуференных растворах Ф-д со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые ухудшают качество фиксации, как и выпадение белого осадка параформальдегида. В результате точную Со Ф-да в растворах формалина установить не представляется возможным. Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70—80° С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электронно-микроскопических исследований.
Фиксатор может показывать себя не с лучшей стороны из-за примесей, в основном метанола(до16%).Для этого существуют методы приготовления свободного от метанола
· 2гр параформальдегида + 50мл 0,1М фосфатного буфера(рН 7,4-7,6)=нагревают до 70с до просветления раствора, помешивают, охлаждают и фильтруют. Его рН 7,3-7,5.
· готовят 40% параформальдегид(40гр порошка формальдегида + 100мл дистиллированной воды при нагревании до 65С, перемешивая.
+ несколько капель 40%гидроксида натрия до просветления раствора.
· Нейтральный 40% формалин 100 мл
· Хлорид натрия 8,5 г
· Водопроводная вода 900 мл
Продолжительность фиксации 48 ч при 20 ° С с последующей промывкой в проточной воде в течение 6—12 ч.
Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли) .
1. А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды.
2. Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия).
3. В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия).
Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов
1. Нитрат свинца 8гр
2. 40% раствор формальдегида 10мл
продолжительность фиксации 24 часа при комнатной Т( при 4С – 2-3дня, 10-14 дней при –25С).
Фиксатор Жандра для гликогена
1. Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей
2. Раствор формальдегида 40% 10 частей
3. Ледяная уксусная кислота 5 частей
Глутаровый альдегид для ферментов.
Обеспечивает наибольшую сохранность ферментов.
· 0,2М фосфатный или какодилатный буфер(рН 7,2-7,4) 50л
· 25%глутаровый альдегид 10мл
Приводит не коагулируются, а желатинизируются, ткани не сморщиваются. Одновременно является контрастирующим веществом в электронной микроскопии. Дорогой реагент, поступает в продажу в ампулах по 0,5 – 2 гр. Разбивают в бумаге и помещают в
воду больше 24ч для 1-4 % раствора. Хранят в темноте при комнатной температуре месяцами. Для первичной фиксации липидов используют 1% раствор на 0,1М фосфатном буфере. Для 1 фиксации
· натрия хлорид 850мг
· 0,2М фосфатный буфер 5мл
Для вторичной используют сахарозу вместо натрия.
· 1% раствор хромовой кислоты на дв 7,5мл
· ледяная уксусная кислота 0,5мл (смешивать перед использованием)
Для стабилизации липидов, для фиксации гликогена и нуклеиновых кислот.
Фиксатор Элфтмана (бихроматсулема)
· Бихромат калия 2,5 гр.
Продолжительность фиксации 3 дня.
4.Этиловый спирт (80 %, 90 %, 96 % и 100 %).
Ацетон (его действие подобно действию спирта). Ацетон используют для увеличения скорости фиксации. Применяют 100% ацетон, для получения которого в коммерческий ацетон засыпают прокаленный сульфат меди (медный купорос) или силикагель. В ацетоне фиксируют кусочки толщиной 3—4 мм в течение 2 ч при 20° С или 30 мин— 1 ч в термостате при 60 °С в плотно закрытой посуде. Ацетон значительно уплотняет ткань и при увеличении продолжительности фиксации возможно сморщивание объектов. Чаще ацетон применяют для обработки материала срочных биопсий при его заливке в парафин.
Азотная, пикриновая, уксусная, трихлоруксусная. Быстро проникают, препятствуют сморщиванию,
ослабляют состояние гидратации. Входят в состав декальцинирующих смесей.
Фиксатор Жандра для гликогена
4. Пикриновая кислота, насыщенная в 96% спирте 85 частей
5. Раствор формальдегида 40% 10 частей
6. Ледяная уксусная кислота 5 частей
классический фиксатор для экспериментальных исследований.
· Насыщенный раствор пикриновой кислоты 75 мл
· Нейтральный 40 % формалин 25 мл
· Ледяная уксусная кислота 5 мл
Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20 °С. Насыщенный раствор пикриновой кислоты готовят заранее из расчета 3 г кристаллической пикриновой кислоты на 1 л горячей дистиллированной воды. После фиксации кусочки отмывают от избытка пикриновой кислоты в 70 % спирте, затем заливают в парафин.
универсальный фиксатор для большинства гистологических и гистохимических исследований (кроме выявления липидов). Наилучший для кожи, для предупреждения пересушивания в качестве промежуточной среды используют хлороформ.
· Спирт 100 % или 96 % 60 мл
· Ледяная уксусная кислота 10 мл
Продолжительность фиксации 2—4 ч при 4 ° С или 1—2 при 20 °С. Затем материал помещают в 100 % спирт. Если материал не сразу подлежит проводке, то его можно перенести 96 % спирт и держать в нем до 3 суток.
Сюда также входят фиксирующие смеси по Боуену, Жандру, Карнуа, Лилли, Ценкеру, Бродскому, прочее.
7.Сулема (дихлорид ртути).
Сулему применяют в качестве фиксатора с начала развития гистологии. Готовят насыщенный раствор: 10 г сулемы на 100 мл дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 3 мм 6—12 ч при 20 °С. При фиксации сулемой возможно появление в тканях кристаллического осадка, который удаляют путем обработки срезов йодированным 70 % спиртом (на 50 мл 70 % спирта — 5—10 капель 5 % спиртового раствора йода до появления оранжевого цвета). По мере обесцвечивания йодированного спирта со срезами его заменяют свежей порцией вплоть до полной потери цвета, затем срезы промывают в 3—4 сменах 70 % спирта.
Составными частями сложных фиксаторов являются простые. Существует множество вариантов фиксирующих смесей. Ниже приведены наиболее распространенные.
Спирт-формол по Шаферу.
· 10 % нейтральный формалин, который готовят из 1 части нейтрального 40 % формалина и
· 2—3 частей 96 % спирта.
Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт.
Кальций-формол по Бейкеру (Проверено) используют для фиксации липидов.
· 10 мл 40% формалина + 90 мл дистиллированной воды.
· 1 г хлорида кальция.
Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.
Для гистохимических исследований с успехом применяют фиксатор Бейкера, приготовленный из параформальдегида.
· К 50 г параформальдегида и 500 мл дистиллированной воды добавляют с одновременным встряхиванием несколько капель 1 н. гидроксида натрия до исчезновения осадка.
· 10 г хлорида кальция + 500 мл дистиллированной воды.
Растворы А и Б смешивают, добавляют 0,5 г активированного угля. Перед использованием фильтруют.
Продолжительность фиксации 24—48 ч при 20°С.
Используется также фиксатор Карнуа, в состав которого входят
· 25 мл ледяной уксусной кислоты
Условия фиксации те же. В случае отсутствия этилового спирта вместо жидкости Карнуа можно использовать смесь следующего состава:
· Изопропиловый спирт 60мл
· Пропионовая кислота 30м
Продолжительность фиксации 12-24 ч при 20 °С; для промывки и обезвоживания применяют изопропиловый спирт.
Жидкость Ценкера — сулемовая смесь.
· Бихромат калия 2,5г
· Сульфат натрия 1 г
· Дистиллированная вод100мл(это-жидкость Мюллера).
· Ледяная уксусная кислота 5мл
Ледяную уксусную кислоту можно заменить нейтральным 10 % формалином (фиксатор Максимова, ценкер-формол). Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20°С. После фиксации материал в течение 12—24 ч отмывают в проточной воде и помещают в йодированный 70% спирт для удаления остатков сулемы. При добавлении 10 мл 2 % раствора тетраоксида осмия хорошо фиксируются и окрашиваются липиды.
В последнее время для гистологических исследований часто применяют глутаровый альдегид, параформальдегид, фиксаторы Ито, Замбони и др., особенно в тех случаях, когда материал предназначается одновременно для нескольких видов исследования (иммуноморфологического, электронно-микроскопического), а его количество ограничено, например, при пункционных биопсиях.
ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ
Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам (альдегиды, ацетоны, спирты), некоторые ядовиты (сулема, тетраоксид осмия, метанол), поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, которые используют в гистологической практике.
Фиксацию и вырезку материала необходимо производить в вытяжном шкафу. Материал, извлеченный из фиксатора, содержащего формалин, желательно в течение нескольких минут промыть в проточной воде, так как пары формалина оказывают раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и органов дыхания.
БЫСТРАЯ ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА СРОЧНЫХ БИОПСИЙ
Доставленный в лабораторию материал в случае необходимости вырезают или разрезают на несколько кусочков и фиксируют с помощью одного из способов быстрой фиксации. Если возможно, то следует часть материала сохранить для изготовления постоянных препаратов.
1. Материал помещают в металлический сосуд с ручкой и заливают теплым 10% нейтральным формалином, доводят до кипения, затем промывают проточной водой в течение 2—5 мин и режут на замораживающем микротоме или криостате.
2. Кусочки фиксируют в 100 % ацетоне в термостате при 56°С в течение 15 мин, затем помещают в хлороформ или ксилол для последующей заливки в парафин.
3. Материал фиксируют в смеси 10 % нейтрального формалина и 96 % спирта (1:1) в течение 15 мин при 56°С, затем промывают в 96 % спирте и обезвоживают в 100 % спирте.
4. М. Vinci и соавторы (1990) предложили метод фиксации кусочков ткани объемом 0,5—1 см 3 с применением микроволновой техники. Материал в растворе альдегида помещают на 20с в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем оставляют на 10— 30 мин при комнатной температуре в том же фиксаторе. Микроволновое излучение способствует быстрому проникновению альдегидов в клетки и ткани, в результате чего улучшается качество фиксации. Этот способ позволяет проводить не только обычные гистологические, но и ультраструктурные цитохимические, иммуноморфологические исследования, а также рентгенологический микроанализ.
ВОЗМОЖНЫЕ АРТЕФАКТЫ, СВЯЗАННЫЕ С ФИКСАЦИЕЙ, И ИХ УСТРАНЕНИЕ
При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Пигмент удаляют, помещая срезы на 15—20 мин в 1—5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в 80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин.
В случаях значительного уплотнения ткани в результате слишком продолжительной фиксации кусочки помещают на 1—2 ч в 10% раствор лимонной кислоты, в результате чего материал становится более мягким и пригодным для исследования.
Кристаллический осадок, образующийся после фиксации с применением сулемы, удаляют из кусочков или лучше срезов с помощью йодированного 70 % спирта.
похожие статьи
Атлас по судебно-медицинской гистологии / Пиголкин Ю.И., Кислов М.А., Должанский О.В., Филиппенкова Е.И., Крупин К.Н. — 2021.
Анализ недостатков судебно-гистологических исследований и пути их устранения / Гедыгушева Н.П., Буланова Э.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 47-49.
Возможности установления некоторых причин смерти гистохимическими методами / Смирнов В.В., Смирнов В.В. // Матер. IV Всеросс. съезда судебных медиков: тезисы докладов. — Владимир, 1996. — №2. — С. 31-32.
Актуальные вопросы гистологического исследования при экспертизе живых лиц / Кулеша Н.В. // Избранные вопросы судебно-медицинской экспертизы. — Хабаровск, 2018. — №17. — С. 125-128.